Ar A4;K599;C58C1;MSU440;Agrobacterium rhizogenes发根农杆菌;pK7WGF2;Streptomycin链霉素;Rifampicin利福平;
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| 货号 |
产品名称 |
规格 |
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| MF2458-0500UL |
Ar A4 Electrocompetent Cell农杆菌电转感受态细胞 |
10×50μl |
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| MF2458-2500UL |
Ar A4 Electrocompetent Cell农杆菌电转感受态细胞 |
50×50μl |
|
菌株描述
发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)是根瘤菌科农杆属的一种革兰氏阴性土壤细菌,能够侵染大多数双子叶植物和少数单子叶植物以及个别裸子植物。起关键作用的是其携带的Ri质粒,含有负责发根自主性生长和冠瘿碱合成的基因。结构上与Ti质粒类似,主要有致毒区(Vir),T-DNA区以及冠瘿碱合成功能区等。
根据合成冠瘿碱的不同,Ri质粒分为4种类型:1)甘露碱型;2)黄瓜碱型;3)农杆碱型;4)米奇矛型。
发根农杆菌菌株Ar A4含天然农杆碱型Ri质粒,具有广泛的宿主范围(玉米,烟草,胡萝卜、甘草等),同时具有卡那霉素抗性。
我司金畔生物提供的Ar A4电转感受态细胞经特殊工艺制作,特别适合大质粒的转化。基因型为Agrobacterium rhizogenes (kanR ) Ar A4 Ri (agropine type),经pK7WGF2质粒(壮观霉素抗性)检测转化效率>105 cfu/μg DNA。
产品包装
| 组分编号 |
组分名称 |
货号(规格) |
| MF2458-0500UL |
MF2458-2500UL |
| MF2458-A |
Ar A4 Electrocompetent Cell |
10×50μl |
50×50μl |
| MF2458-B |
pK7WGF2 Control Vector (10ng/μl) |
10μl |
10μl |
保存与运输条件:
保存:-80℃保存,1年有效。
运输:干冰运输。
注意事项
1) 感受态细胞应保存在-80℃,不可反复冻融和放置时间过长,以免降低感受态细胞的转化效率。
2) 整个转化操作,严格根据相应温度及无菌条件要求进行。
3) 加入质粒的体积不应大于感受态体积的1/10。质粒不纯或存在乙醇等有机物污染,会导致转化效率急剧下降。质粒增大一倍,转化效率下降一个数量级。
4) 为确保最高转化效率,整个操作过程应尽量轻柔,并保持低温。
5) 电转感受态细胞中不可混入气泡,转化高浓度的质粒可相应减少最终涂板用量。
6) 平板上克隆密度过大时,由于营养不足,克隆生长变慢,菌落变小。为获得大菌落,应减少质粒用量。
7) Ar A4具卡那霉素抗性,不可用于具卡那霉素抗性质粒的转化。
8) 为了保证最佳的转化效率,发根农杆菌的培养务必使用TY培养基(配方见附表1)。
9) 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用方法
1) 将0.1 cm电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净吸水纸上5min,待其沥干水分,正置5min,使乙醇充分挥发干净,立即插入冰中,压实冰面,电极杯顶离冰面0.5cm以方便盖上杯盖,冰中静置5min使其充分降温。
2) 取-80℃保存的农杆菌感受态细胞插入冰中5min,待其完全融化。
3) 往50μl感受态细胞悬液中加入0.01~1μg(体积不大于6μl)质粒DNA,用手拨打管底使其混匀,立即插入冰中。用枪轻轻吹打混匀感受态细胞-质粒之后快速转移到电击杯中,盖上杯盖,空管保留待用【注意:质粒DNA最好用试剂盒抽提,且用双蒸水溶解。由于感受态转化效率较高,第一次使用最好做预试验确定最佳的质粒用量】。
4) 启动电转仪,设置参数:C=25 μF,PC=200 ohm,V=2400 V(此参数参考Bio-rad,具体使用请参考电转仪推荐步骤来操作),将电击杯从冰中取出,吸水纸吸干外表面水分,快速放入电转槽中,启动电击,电击完成快速插入冰中。
5) 加入1ml无抗生素的TY并转移到感受态空管中,于28℃振荡培养2~3h。
6) 6,000rpm离心1min,留取100ul左右上清,之后用枪轻轻吹打重悬菌体。之后加到含相应抗生素的TY平板上,用无菌玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。室温正置10 min,待液体被吸收后,倒置平板,28℃培养2-3天。
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附表1固体和液体TY培养基配方
| 组分Component |
TY(液体)/升 |
TY(固体)/升 |
| 胰蛋白胨Tryptone |
5g |
5g |
| 酵母提取物Yeast extract |
3g |
3g |
| 琼脂Agar |
/ |
15g |
|
补水到1L,121℃,20min高压灭菌 |
补水到1L,121℃,20min高压灭菌 |
| 氯化钙CaCl2 |
配制1M CaCl2水溶液,121℃,20min高压灭菌。之后按照10ml/L加入上方灭菌的液体营养液。 |
配制1M CaCl2水溶液,121℃,20min高压灭菌。之后按照10ml/L加入上方灭菌的液体营养液。 |
附表2常见发根农杆菌对抗生素敏感性总表
| 农杆菌菌株 |
羧苄(carb) |
链霉素(strep) |
利福平(rif) |
庆大霉素(gent) |
卡那霉素(kan) |
| Ar A4 |
S |
S |
S |
S |
R |
| Ar Qual |
S |
R |
S |
R |
S |
| Ar 1193 |
R |
R |
R |
S |
S |
| K599 |
S |
R |
S |
S |
S |
| C58C1 |
S |
R |
R |
S |
S |
| MSU440 |
S |
R |
S |
S |
S |
| 【备注】:S代表敏感,R代表抗性。 |
附表3常见农杆菌抗生素配制方法
| 抗生素 |
配方 |
母液 |
工作液 |
| 羧苄青霉素 |
去离子水溶解,0.22μm滤膜除菌 |
50mg/ml |
50μg/ml |
| 硫酸卡那霉素 |
去离子水溶解,0.22μm滤膜除菌 |
50mg/ml |
50μg/ml |
| 链霉素 |
去离子水溶解,0.22μm滤膜除菌 |
10mg/ml |
50μg/ml |
| 庆大霉素 |
去离子水溶解,0.22μm滤膜除菌 |
20mg/ml |
40μg/ml |
| 利福平 |
DMSO溶解,0.22μm有机相滤膜除菌 |
10mg/ml |
20μg/ml |
| 氯霉素 |
无水乙醇溶解,0.22μm有机相滤膜除菌 |
34mg/ml |
34μg/ml |