KAPA文库定量试剂盒试验操作步骤

KAPA文库定量试剂盒试验操作步骤
高准确度定量可测序的文库分子对于平衡不同样品的混样量,最大化程度利用测序仪的通量及节省测序成本等至关重要。KAPA 文库定量试剂盒是业界公认的“金标准”,可对连接上接头的单链或双链文库分子进行高准确度、可重复地定量,确保多重样品的等摩尔混合。
KAPA文库定量试剂盒
Illumina平台的KAPA文库定量试剂盒提供了基于qPCR的Illumina文库绝对定量所需的全部试剂,这些文库两端带有P5和P7流动槽寡核苷酸序列。该试剂盒包含新型KAPA SYBR FAST DNA聚合酶,一种通过定向进化工程优化,适用于SYBR Green I的高性能qPCR酶。工程优化的聚合酶能够以相似的效率扩增多种DNA片段,因此能够使用通用的标准品可靠地定量平均片段长度最高达1 kb的所有Illumina文库,无需考虑文库类型和GC含量。KAPA SYBR FAST是一种抗体介导的热启动 DNA聚合酶制剂。因此,KAPA文库定量试剂盒也适用于自动化液体处理系统,进行高通量样品定量。
本文档适用于Illumina平台的KAPA文库定量试剂盒(07960166001、07960140001、07960204001、07960255001、07960336001和07960298001)、Illumina平台的KAPA文库定量引物和PCR混合物试剂盒 (07960441001、07960484001、07960522001、07960727001和07960573001)、Illumina平台的KAPA文库定量标准品和引物试剂盒(07960085001)、Illumina平台的KAPA文库定量标准品试剂盒(07960409001和07960409001)、Illumina平台的KAPA文库定量稀释对照试剂盒(07960417001)和Illumina平台的KAPA文库定量引物试剂盒(07960093001)。

产品描述

 

 

 

 

 

 

Illumina平台的KAPA文库定量试剂盒提供了基于qPCR的Illumina文库绝对定量所需的全部试剂,这些文库两端带有P5和P7流动槽寡核苷酸序列。试剂盒包含:

● 文库定量DNA标准品1-6(线性、452 bp模板的10倍稀释系列)
● Library Quantification Primer Premix 文库定量引物预混液(10x),含有以下引物:
引物1:5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GA-3′
引物2:5′-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA-3′
● KAPA SYBR® FASTqPCR预混液(2x),含有各种被动参比染料(表1)。

表1. 推荐用于KAPA SYBR FAST通用qPCR预混液的ROX浓度

文库定量的方法为:通过使用KAPA SYBR FASTqPCR预混液和靶向Illumina P5和P7流动槽寡核苷酸序列的引物,使用qPCR扩增一组六份预稀释的DNA标准品和稀释的文库样本,进行文库定量。将每份DNA标准品的平均Cq值取log10(以pM表示浓度)作图,以生成标准曲线。然后使用绝对定量,通过标准曲线计算稀释的文库样本的浓度。

KAPA文库定量试剂盒经过严格测试,以确保最小的批次间差异。该试剂盒包含新型KAPA SYBR FAST DNA聚合酶,一种通过定向进化工程优化,适用于SYBR Green I的高性能qPCR酶。工程优化的聚合酶能够以相似的效率扩增多种DNA片段,因此能够使用通用的标准品可靠地定量平均片段长度最高达1 kb的所有Illumina文库,无需考虑文库类型和GC含量。

KAPA SYBR FAST是一种抗体介导的热启动 DNA聚合酶制剂。因此,KAPA文库定量试剂盒适用于自动化液体处理系统,进行高通量样品定量。

产品应用

Illumina平台的KAPA文库定量试剂盒旨在为准备Illumina测序的文库进行准确和可重复的定量。只要文库的浓度 > 0.0002 pM,且含有与引物预混液(10x)中的引物互补的序列,无论哪种文库类型、文库构建方式和使用哪种Illumina测序设备,均可以使用该试剂盒进行定量。

该试剂盒可定量GC含量高和平均片段长度高达1 kb的文库。

除了NGS文库定量,该试剂盒还可用于检测Illumina文库构建过程中的工作场所的文库污染。

KAPA文库定量检测包括可以轻易实现自动化的重复移液步骤。强烈推荐将自动化液体处理系统用于高通量NGS处理流程。有关更多信息,请参阅原说明书KAPA文库定量技术指南。

工作流程图

实验操作流程

        1. 试剂准备
          1.1
          准备适量的DNA稀释缓冲液[10 mM Tris-HCl,pH 8.0-8.5(25 °C) + 0.05% Tween® 20(可选)]。该缓冲液可储存在室温或4 °C,并可重复使用。需始终在使用前将缓冲液平衡至室温。
          1.2
          需确保KAPA文库定量试剂盒的所有组分都完全解冻并彻底混合。
          1.3
          如果首次使用该试剂盒,将引物预混液(10x)(1 ml)加入KAPA SYBR® FASTqPCR预混液(2x)(5 ml)的瓶中。使用涡旋混合器彻底混合。
          注意:如果您使用的是通用qPCR预混液试剂盒,且仅使用高浓度ROX染料或低浓度ROX染料,则在首次打开试剂盒时,可将适合的ROX溶液(50x)(0.2 ml)和引物添加到qPCR预混液中。应相应地调整每次反应所用的该混合液的体积(每20 μl反应使用12.4 μl或每10 μl反应使用6.2 μl)。
          1.4
          记录所有试剂的批号,以及引物(和ROX)被添加到qPCR预混液的日期。含有引物(和ROX)的KAPA SYBR FASTqPCR预混液经过30次冻融循环仍能保持稳定,在不使用时应避光保存在-20 °C下。如果混合液在反应设置的制备或随后使用过程中并未被微生物和/或核酸酶污染,那么可以在4 °C的暗处储存 ≤ 1周。
        2. 样本准备
          2.1
          准备合适的文库稀释液(使用DNA稀释缓冲液)。根据文库的预期浓度,可采取1:1,000-1:100,000的稀释度。建议对每个文库额外进行至少一次2倍稀释。
          2.2

          准备所需的内部质控稀释液(表1)。

        3. 反应设置和循环
          3.1
          确定以下每个反应的适当重复次数所需进行的反应总数:
          ● 6份DNA标准品
          ● 待测文库的每个稀释度
          ● 内部质控的每个稀释度
          ● 无模板质控品(NTCs)。
          3.2
          使用以下推荐的反应设置准备所需量的预混液体积。
          反应设置:20 μl反应

          1如果将ROX添加到qPCR预混液和引物中,则每次反应将使用12.4 μl的含有引物预混液和ROX的qPCR预混液。

          反应设置:10 μl反应

          1如果将ROX添加到qPCR预混液和引物中,则每次反应将使用6.2 μl的含有引物预混液和ROX的qPCR预混液。
          2如果在反应设置期间添加ROX,则推荐的反应设置会使总反应体积为10.2 μl。这不会影响试剂盒性能。

          3.3
          混合并短暂离心试剂预混液。
          3.4
          将适量预混液分配到每个PCR管或孔中。
          3.5
          向所有NTC孔/管中加入4 μl PCR级水。
          3.6
          按照从最低浓度(标准品6)到最高浓度(标准品1)的顺序,将4 μl每种DNA标准品分配到适当的孔/管中。
          3.7
          吸取4 μl每种稀释的文库和内部质控品进行分析。
          3.8
          盖上管或密封PCR板,并转移到qPCR设备上。
          3.9
          使用以下循环方案进行qPCR,在设备软件中选择绝对定量选项。根据需要调整运行参数(例如,报告基因、参考染料、增益设置等)。

          1长插入片段的文库(> 700 bp)增加到90秒。
          2可选;有关更多详细信息,请参阅数据分析和解读(原说明书第9页)。
        4. 数据分析
          注:在工作示例(步骤5)中提供了文库定量数据分析的工作示例。

          4.1
          如下所述标注DNA标准品。注意,特定的值是对应于DNA标准品的浓度,而不是每个反应中的最终DNA浓度。只要所有反应使用的是相同体积的模板(DNA标准品、稀释的文库或内部质控品),就不必将它们转换为反应中的实际浓度。
          4.2
          检查扣除背景的(标准化的)扩增曲线和重复数据点(DNA标准品、文库和质控品)的Cq值,并排除明显的异常值。重复数据点应相差 ≤ 0.2个循环。如果数据集包含许多异常值,则结果不太可靠。进行重复检测,特别注重提高移液的准确性。
          4.3
          排除超出检测动态范围的所有文库稀释液,即去掉低于标准品1或高于标准6的平均Cq值。如果文库的所有稀释度都超出标准曲线,则重新定量一个更合适的文库稀释度。
          4.4
          使用设备软件生成标准曲线。也可以使用KAPA文库定量数据分析模板手动生成标准曲线。
          4.5
          查看标准曲线以确保满足以下条件:
          ● DNA标准品之间的平均ΔCq值在3.1-3.6的范围内。
          ● 计算的反应扩增效率在90-110%的范围内(即,PCR产物每循环增加1.8-2.2倍,标准曲线的斜率在-3.1和-3.6之间)。
          ● R2 ≥ 0.99。

          如果标准曲线不符合这些标准,则计算的文库浓度将不可靠,必须重复测定。
          4.6
          大多数qPCR软件会使用针对标准曲线的绝对定量来计算经稀释的文库和质控的浓度。但是,我们建议将qPCR数据导出到KAPA文库定量数据分析模板,以执行以下计算从而确定未稀释的文库浓度:
          ● 使用标准曲线将每个文库和内部质控品的每个稀释度的平均Cq值转换为平均浓度(以pM计)。
          ● 通过计算的平均浓度乘以以下因子,计算测定的每个文库和质控的每个稀释液的平均片段大小调整浓度(以pM计):

          有关片段大小调整计算的更多信息,请参阅数据分析和解读(原说明书第9页)。
          ● 根据每个文库或质控品的每种稀释度乘以适当稀释倍数,再根据文库或质控品的长度,计算来自每种测定文库或质控品的原始浓度。

          4.7
          检查最终计算的浓度,并确定用于下游处理的每个样本的工作浓度(例如,用于靶向富集或成簇扩增的收集)。
        5. 工作示例
          使用KAPA LTP文库构建试剂盒从250 ng经Covaris片段化的人类基因组DNA出发,制备3个带Index的DNA文库,适用于Illumina HiSeq 2500的2 × 100 bp配对末端全基因组测序。对接头连接的文库进行片段选择(250-450 bp)并扩增(6个循环)。使用Agilent Bioanalyzer高灵敏度DNA检测试剂盒分析扩增的文库,以确定每个文库的平均片段大小和大致浓度(表2,第1行和第2行)。为每个文库制备初步的1:10,000稀释液和另外一份2倍(即1:20,000)稀释液。作为流程质控,还制备了1:10,000和1:20,000稀释的KAPA文库定量内部质控品(Illumina DNA标准品0,200 pM)。使用KAPA文库定量试剂盒检测样本。所有DNA标准品和文库稀释液均需进行3次重复检测,对NTCs也进行3次重复检测。

          6种DNA标准品和NTCs的三次重复检测和平均Cq值将在下表中给出。

          *对于10倍系列稀释的模板,应为3.1-3.6。

          排除DNA标准品2和6的异常值(> 0.2 Ct差异)后,生成标准曲线(图1)。标准曲线的质量控制指标如下:
          ● 所有相邻两个DNA标准品的ΔCq均在3.1-3.6的特定范围内。
          ● 95%的扩增效率在90-110%的特定范围内。
          ● R2值为0.9999符合 ≥ 0.99的技术参数。


          图1.使用Illumina测序平台的KAPA文库定量试剂盒生成标准曲线

          表2第4行给出了3个文库和内部质控品的每个稀释度的三份Cq值。在计算每份样本的平均Cq值(第5行)之前,排除文库1的1:20,000稀释度和文库3的1:10,000稀释度的异常值(> 0.2 Ct差异)。

          为了指示所计算浓度的可靠性,需要计算每个文库和内部质控的两个稀释度的ΔCq。对于一份样本的连续2倍稀释,预期ΔCq为1.0,并且介于0.9和1.1之间的值是可接受的。这表明,由两种或更多种稀释度计算的文库浓度可能相差 < 10%。如果样本连续稀释的ΔCq值落在可接受的范围之外,则表明由于液体处理不佳和/或样品污染,定量结果可能不可靠。

          为了计算每个文库的工作浓度,需确定两种不同稀释度之间的差异。由于所有文库的计算浓度均存在< 10%的差异,故选择两种稀释液的平均值作为工作浓度。如果两个值相差> 10%,则工作浓度应基于以下之一:
          ● 从最终计算浓度值差异< 10%的稀释液得出的平均值。
          ● 每个文库的最低稀释度的最终计算浓度应该是可靠的。

          接下来,使用标准曲线将每个文库/质控稀释液的平均Cq值转换为浓度(以pM计)(表2,第7行)。随后根据每个文库的平均片段大小计算文库浓度(如实验操作流程中所述(步骤4.6);表2,第8行)。最后,根据每个测定的稀释液浓度,计算每个未稀释文库和质控品的平均终浓度(以nM计)(表2,第9行)。内部质控品的计算浓度(分别为1:10,000和1:20,000稀释度为205.4 pM和207.8 pM)在给定值 ± 10%范围内,表明在样本稀释或检测设置和执行过程中没有发生严重错误。

          表2. 用于Illumina测序的基于qPCR的文库定量的工作示例

使用过本产品的部分文献

      1. Carpenter, M. L., Buenrostro, J. D., Valdiosera, C., Schroeder, H., Allentoft, M. E., Sikora, M., Rasmussen, M., Gravel, S., Guillen, S., Nekhrizov, G., Leshtakov, K., Dimitrova, D., Theodossiev, N., Pettener, D., Luiselli, D., Sandoval, K., Moreno-Estrada, A., Li, Y., Wang, J., Gilbert, M. T., Willerslev, E., Greenleaf, W. J. and Bustamante, C. D. (2013). Pulling out the 1%: whole-genome capture for the targeted enrichment of ancient DNA sequencing libraries. Am J Hum Genet 93(5): 852-864.
      2. Colman, R. E., Schupp, J. M., Hicks, N. D., Smith, D. E., Buchhagen, J. L., Valafar, F., Crudu, V., Romancenco, E., Noroc, E., Jackson, L., Catanzaro, D. G., Rodwell, T. C., Catanzaro, A., Keim, P. and Engelthaler, D. M. (2015). Detection of low-level mixed-population drug resistance in mycobacterium tuberculosis using high fidelity amplicon sequencing. PLoS One10(5): e0126626.
      3. Iha, C., Grassa, C. J., Lyra, G. M., Davis, C. C., Verbruggen, H. and Oliveira, M. C. (2018). Organellar genomics: a useful tool to study evolutionary relationships and molecular evolution in Gracilariaceae (Rhodophyta). J Phycol 54(6): 775-787.
      4. Kasparovska, J., Pecinkova, M., Dadakova, K., Krizova, L., Hadrova, S., Lexa, M., Lochman, J. and Kasparovsky, T. (2016). Effects of isoflavone-enriched feed on the rumen microbiota in dairy cows. PLoS One 11(4): e0154642.
      5. Symons, J., Chopra, A., Malatinkova, E., De Spiegelaere, W., Leary, S., Cooper, D., Abana, C. O., Rhodes, A., Rezaei, S. D., Vandekerckhove, L., Mallal, S., Lewin, S. R. and Cameron, P. U.(2017). HIV integration sites in latently infected cell lines: evidence of ongoing replication. Retrovirology 14(1): 2.

KAPA KK8000, KK8001与KK8002-纯化磁珠(Pure Beads)

KAPA KK8000, KK8001与KK8002-纯化磁珠(Pure Beads)

KAPA纯化磁珠(Pure Beads)
KAPA纯化磁珠为DNA和RNA的二代测序建库流程中的反应纯化、片段筛选,提供了灵活可调、表现稳定的解决方案。快速、高效的去除实验多余组分,针对单链和双链DNA兼具高回收效率。

Product Description

KAPA Pure Beads is a suspension of paramagnetic beads in a buffer optimized for the purification or size selection of single- and double-stranded DNA in next-generation sequencing and other molecular biology workflows. The product is designed for fast and reliable purification or size selection of 1 ng to 5 µg DNA in a single reaction. KAPA Pure Beads is compatible with manual processing or automated liquid handling and enables efficient recovery of input DNA in both formats.

For purification and size selection of DNA, the KAPA Pure Beads buffer includes PEG/NaCl—a crowding agent designed to drive DNA molecules to the beads for binding. The volumetric ratio of KAPA Pure Beads to sample is the critical factor in determining the size distribution of DNA fragments retained by the beads. The volume (ratio) may be modified/optimized based upon the specific application and/or point in the library construction workflow where a cleanup or size selection is employed.

Product Applications

KAPA Pure Beads is ideally suited for:
● fast and efficient reaction cleanups to remove adapters, adapter-dimers, primers, primer-dimers, nucleotides, salts, and enzymes in NGS library preparation, PCR, and qPCR workflows,
● size selection of fragmented input DNA, adapter- ligated library molecules, or amplified libraries in NGS library preparation workflows, and
● general manipulation of DNA samples, e.g., sample concentration and buffer exchange (e.g., from salts, buffer components, enzymes, etc.).

Protocols

  1. Genomic DNA Purification (Cleanup)
    Prior to library construction in NGS workflows, it may be beneficial to perform an upfront genomic DNA cleanup. For cleanup, buffer exchange, and/ or concentration of high-quality genomic DNA prior to library construction, a KAPA Pure Beads- to-sample volumetric ratio of 3X is recommended.

    The detailed protocol below is an example of a 3X cleanup of genomic DNA in 100 µL. Please pay special attention to steps 1.15 and 1.16 (elution of DNA off beads). To ensure optimal recovery, these steps may be performed at an elevated temperature: 37°C for 10 min. Elution buffer may be pre-heated for this step and/or the elution performed in a thermocycler or heating block. The heated elution is not required for the cleanup, purification, or buffer exchange of other DNA types, e.g., fragmented DNA, NGS libraries or amplicons.

    Ensure that the plate/tube(s) selected for the cleanup can accommodate the DNA sample plus the appropriate volume of KAPA Pure Beads, and that it is compatible with your magnet and heating device.

    1.1
    Ensure that KAPA Pure Beads has been equilibrated to room temperature and that the beads are fully resuspended before proceeding.
    1.2
    Add 300 µL of KAPA Pure Beads to the 100 µL genomic DNA sample.
    1.3
    Mix thoroughly by vortexing and/or pipetting up and down multiple times.
    1.4
    Incubate the plate/tube(s) at room temperature for 10 min to bind the DNA to the beads.
    1.5
    Place the plate/tube(s) on a magnet to capture the beads. Incubate until the liquid is clear.
    1.6
    Carefully remove and discard the supernatant.
    1.7
    Keeping the plate/tube(s) on the magnet, add 200 µL of 80% ethanol.
    1.8
    Incubate the plate/tube(s) on the magnet at room temperature for ≥30 sec.
    1.9
    Carefully remove and discard the ethanol.
    1.10
    Keeping the plate/tube(s) on the magnet, add 200 µL of 80% ethanol.
    1.11
    Incubate the plate/tube(s) on the magnet at room temperature for ≥30 sec.
    1.12
    Carefully remove and discard the ethanol. Try to remove all residual ethanol without disturbing the beads.
    1.13
    Dry the beads at room temperature for 3 – 5 min, or until all of the ethanol has evaporated.
    Caution: over-drying the beads may result in reduced yield.
    1.14
    Remove the plate/tube(s) from the magnet.
    1.15
    Resuspend the beads in an appropriate volume of pre-heated elution buffer at 37 °C and/or perform the elution incubation (step 1.16) in a thermocycler or heating block set to 37 °C. The appropriate elution buffer may be either 10 mM Tris-HCl, (pH 8.0 – 8.5) or PCR-grade water, depending on the downstream application.
    1.16
    Incubate the plate/tube(s) for 10 min to elute the DNA off the beads.
    1.17
    Place the plate/tube(s) on a magnet to capture the beads. Incubate until the liquid is clear.
    1.18
    Transfer the clear supernatant to a new plate/ tube(s). Proceed with your downstream application, or store DNA at 2 °C to 8 °C for 1 – 2 weeks, or at -15 °C to -25 °C.
  2. Cleanup of Fragmented DNA in NGS Workflows
    In NGS library construction workflows, the appropriate bead-to-sample ratio depends on the point in the workflow at which the cleanup is performed (e.g., after fragmentation, adapter ligation, or library amplification), and the desired fragment sizes to be retained/excluded. KAPA Pure Beads may be employed for the effective cleanup of fragmented DNA at various stages of NGS library preparation workflows.

    The size range of DNA fragments recovered during a single-sided bead-based cleanup is dependent on the volume (ratio) of KAPA Pure Beads added to the DNA sample. For fragmented DNA, NGS libraries, and amplicons, recommendations for KAPA Pure Beads-to-sample volumetric ratios based upon desired fragment lengths to be retained are provided in Table 2 (shown in Figure 1), and should be used as a guideline.

    The detailed protocol outlined below is an example of a 0.8X cleanup of a 100 µL fragmented DNA sample.

    2.1
    Ensure that KAPA Pure Beads has been equilibrated to room temperature and that the beads are fully resuspended before proceeding.
    2.2
    Add 80 µL of KAPA Pure Beads to the 100 µL fragmented DNA sample.
    2.3
    Mix thoroughly by vortexing and/or pipetting up and down multiple times.
    2.4
    Incubate the plate/tube(s) at room temperature for 5 – 15 min to bind the DNA to the beads.
    2.5
    Place the plate/tube(s) on a magnet to capture the beads. Incubate until the liquid is clear.
    2.6
    Carefully remove and discard the supernatant.
    2.7
    Keeping the plate/tube(s) on the magnet, add 200 µL of 80% ethanol.
    2.8
    Incubate the plate/tube(s) on the magnet at room temperature for ≥30 sec.
    2.9
    Carefully remove and discard the ethanol.
    2.10
    Keeping the plate/tube(s) on the magnet, add 200 µL of 80% ethanol.
    2.11
    Incubate the plate/tube(s) on the magnet at room temperature for ≥30 sec.
    2.12
    Carefully remove and discard the ethanol. Try to remove all residual ethanol without disturbing the beads.
    2.13
    Dry the beads at room temperature for 3 – 5 min, or until all of the ethanol has evaporated.
    Caution: over-drying the beads may result in reduced yield.
    2.14
    Remove the plate/tube(s) from the magnet.
    2.15
    Resuspend the beads in an appropriate volume of elution buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0 – 8.5) or PCR-grade water, depending on the downstream application.
    2.16
    Incubate the plate/tube(s) at room temperature for 2 min to elute the DNA off the beads. The elution time may be extended up to 10 min if necessary to improve DNA recovery.
    2.17
    Place the plate/tube(s) on a magnet to capture the beads. Incubate until the liquid is clear.
    2.18
    Transfer the clear supernatant to a new plate/ tube(s). Proceed with your downstream application, or store DNA at 2°C to 8°C for 1 – 2 weeks, or at -15°C to -25°C.

    Table 2: Guidelines for the purification (cleanup) of fragmented DNA, NGS libraries, and amplicons with KAPA Pure Beads


    Figure 1. Effect of KAPA Pure Beads-to-sample ratio on the recovery of dsDNA fragments. A defined mixture of dsDNA fragments (ranging from 100 bp to 10 kb) was processed using various KAPA Pure Beads-to-sample ratios. The impact on DNA fragment size retention was assessed with an Agilent® Bioanalyzer 2100 High Sensitivity DNA Kit. Retained DNA fragment lengths are inversely proportional to the bead-to-sample ratio; a greater volume or ratio of beads is required to retain lower molecular weight fragments.

  3. Size Selection in NGS Workflows
    Size selection requirements vary widely for different sequencing applications. KAPA Pure Beads may be integrated into most DNA library construction workflows, and size selection can be carried out at various points in the overall workflow (e.g., after fragmentation, post-ligation cleanup, or library amplification).

    Guidelines for size selection of Illumina libraries with KAPA Pure Beads are given in Table 3, and representative traces of size-selected input DNA and libraries are given in Figure 2. These parameters are provided as guidelines only and may require additional optimization.

    The following detailed protocol is an example of size selection of adapter-ligated library in a 50 µL volume. As per Table 3, a 0.6X – 0.8X size selection is used to target a final library size distribution of 250 – 450 bp. The first 0.6X cut is designed to exclude molecules > 450 bp from the library-containing supernatant retained for the second cut. The additional 0.2 volumes of KAPA Pure Beads results in the binding of all molecules > 250 bp (but < 450 bp) to the beads. DNA fragments < 250 bp are discarded with the supernatant during the bead washes.

    3.1
    Ensure that KAPA Pure Beads has been equilibrated to room temperature and that the beads are fully resuspended before proceeding.
    3.2
    Perform the first size cut (0.6X, to exclude large library fragments) by adding 30 µL of KAPA Pure Beads to 50 µL of adapter-ligated library (0.6 x 50 µL = 30 µL).
    3.3
    Mix thoroughly by vortexing and/or pipetting up and down multiple times.
    3.4
    Incubate the plate/tube(s) at room temperature for 5 – 15 min to bind large library molecules (> 450 bp) to the beads.
    3.5
    Place the plate/tube(s) on a magnet to capture the beads. Incubate until the liquid is clear.
    3.6
    Carefully transfer the supernatant containing the smaller library molecules (< 450 bp) to a new plate/ tube(s). It is critical that no beads are transferred with the supernatant.
    3.7
    Discard the plate/tube(s) containing the beads to which library fragments larger than ~450 bp are bound.
    3.8
    Perform the second size cut (0.8X) by adding 10 µL of KAPA Pure Beads to the supernatant. This volume is calculated relative to the original sample volume of 50 µL, e.g., (0.8 – 0.6) x 50 µL = 10 µL.
    3.9
    Mix thoroughly by vortexing and/or pipetting up and down multiple times.
    3.10
    Incubate the plate/tube(s) at room temperature for 5 – 15 min to bind library molecules > 250 bp to the beads.
    3.11
    Place the plate/tube(s) on a magnet to capture the beads. Incubate until the liquid is clear. Carefully remove and discard the supernatant which contains library molecules smaller than > 250 bp.
    3.12
    Keeping the plate/tube(s) on the magnet, add 200 µL of 80% ethanol.
    3.13
    Incubate the plate/tube(s) on the magnet at room temperature for ≥ 30 sec.
    3.14
    Carefully remove and discard the ethanol.
    3.15
    Keeping the plate/tube(s) on the magnet, add 200 µL of 80% ethanol.
    3.16
    Incubate the plate/tube(s) on the magnet at room temperature for ≥ 30 sec.
    3.17
    Carefully remove and discard the ethanol. Try to remove all residual ethanol without disturbing the beads.
    3.18
    Dry the beads at room temperature for 3 – 5 min, or until all of the ethanol has evaporated.
    Caution: over-drying the beads may result in reduced yield.
    3.19
    Remove the plate/tube(s) from the magnet.
    3.20
    Thoroughly resuspend the beads in the required volume of elution buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0 – 8.5), or PCR-grade water, depending on the downstream application.
    3.21
    Incubate the plate/tube(s) at room temperature for 2 min to elute DNA off the beads. The elution time may be extended up to 10 min if necessary to improve DNA recovery.
    3.22
    Place the plate/tube(s) on a magnet to capture the beads. Incubate until the liquid is clear.
    3.23
    Transfer the clear supernatant with size-selected DNA to a new plate/tube(s). Proceed with your downstream application, or store DNA at 2°C to 8°C for 1 – 2 weeks, or at -15°C to -25°C.

    Table 3: Guidelines for size selection with KAPA Pure Beads

    1Adapter ligation increases the length of DNA fragments. To achieve the same final fragment size, a lower ratio of KAPA Pure Beads is therefore required for the first cut when performing size selection after ligation or library amplification, as opposed to after fragmentation. Please refer to Figure 2 for more details.
    2These size selection parameters were optimized for libraries prepared with single-indexed, Illumina TruSeq-style adapters. Parameters have to be optimized for libraries prepared with dual-indexed adapters, shorter or custom adapter designs.
    3When performing size selection after ligation, it is important to perform at least one post-ligation cleanup, as KAPA Ligation Buffers contain high concentrations of PEG 6000, which will interfere with size selection (double-sided cleanups) if not removed.


    Figure 2. Examples of input DNA and NGS libraries subjected to bead-based size selection using KAPA Pure Beads at different stages of the library construction process.
    A. Size distributions of fragmented input DNA (no size selection), vs. final, amplified libraries prepared from the same DNA, but size selected after fragmentation or after ligation, respectively. Since the mode fragment size of input DNA increases after adapter ligation, the KAPA Pure Beads-to-sample volumetric ratio used for the first cut during post- ligation size selection was lower than for post-fragmentation size selection to target the same final mode library size distribution (300 – 750 bp).
    B. Size distributions for final, amplified libraries that were not size selected vs. libraries prepared from the same input DNA, but size selected with different parameters after the post-ligation cleanup to achieve different final size distributions (as outlined in Table 2).
    All libraries were prepared with the KAPA Hyper Prep Kit, from 100 ng high-quality human genomic DNA, fragmented with a Covaris E220 Focused Ultrasonicator using conditions optimized to yield a mode fragment length in the range of 350 – 450 bp. Electropherograms were generated with a Bioanalyzer 2100 High Sensitivity DNA Kit. DNA concentrations were normalized prior to analysis and are not reflective of actual concentrations at different stages of the library preparation workflow.

Troubleshooting

KAPA KK2631 热启动HiFi高保真酶 HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit

KAPA KK2631 热启动HiFi高保真酶 HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit

KK2631 KAPA热启动HiFi高保真酶预混液50mL
英文名称:KAPA HiFi HotStart ReadyMix Kit (50mL)
产地/品牌:kapa
规 格:50mL/2000*50μL rxn/4000*25μL rxn 2000
货 号:KK2631

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Product Description  产品描述

KAPA HiFi HotStart DNA Polymerase is a novel B-family DNA polymerase, engineered to have increased affinity for DNA, without the need for accessory proteins or DNA binding domains. The intrinsic high processivity of the enzyme results in significant improvement in yield, speed and sensitivity when compared with wild-type B-family DNA polymerases. In addition, the ability to amplify long targets, as well as GC- and AT-rich targets, is significantly improved. The enzyme is combined with a proprietary antibody that inactivates the enzyme until the first denaturation step. This prevents nonspecific amplification during reaction setup, increases sensitivity, and improves reaction efficiency.

KAPA HiFi HotStart DNA 聚合酶是一种新型 B 家族 DNA 聚合酶,经过精心设计,可增强对 DNA 的亲和力,无需辅助蛋白或 DNA 结合结构域。 与野生型 B 家族 DNA 聚合酶相比,该酶固有的高持续合成能力导致产量、速度和灵敏度显着提高。 此外,扩增长靶标以及富含 GC 和 AT 的靶标的能力显着提高。 该酶与一种专有抗体相结合,使酶失活直到第一个变性步骤。 这可以防止反应设置期间的非特异性扩增,提高灵敏度并提高反应效率。

In the ReadyMix PCR Kit, KAPA HiFi HotStart DNA Polymerase is supplied in a convenient 2X ReadyMix format, containing all reaction components except primers and template. The ReadyMix contains KAPA HiFi HotStart DNA Polymerase (0.5 U per 25 μL reaction) in a proprietary reaction buffer containing dNTPs (0.3 mM of each dNTP at 1X), MgCl2 (2.5 mM at 1X) and stabilizers.

KAPA HiFi HotStart ReadyMix is designed for routine, high-fidelity PCR of a wide range of targets and fragment sizes. It offers error rates approximately 100 times lower than wild-type Taq DNA polymerase, and higher success rates and yields than achievable with wild-type B-family (proofreading) DNA polymerases. In addition, KAPA HiFi HotStart requires significantly shorter reaction times than wild-type B-family DNA polymerases.

KAPA HiFi HotStart DNA Polymerase has 5’→3’ polymerase and 3’→5’ exonuclease (proofreading) activity, but no 5’→3’ exonuclease activity. The strong 3’→5’ exonuclease activity results in superior accuracy during DNA amplification, lending to KAPA HiFi HotStart DNA Polymerase the lowest published error rate of all B-family DNA polymerases (1 error per 3.6 x 106 nucleotides incorporated). This fidelity is approximately 100 times higher than that of wild-type Taq DNA polymerase, and up to 10 times higher than that of other B-family DNA polymerases and polymerase blends.

DNA fragments generated with KAPA HiFi HotStart ReadyMix may be used for routine downstream analysis and applications, including restriction enzyme digestion, cloning and sequencing. PCR products generated with KAPA HiFi HotStart ReadyMix are blunt-ended, but may be 3’-dA-tailed for cloning into TA cloning vectors (see Important Parameters: TA cloning).

Product Applications  产品应用

The KAPA HiFi HotStart PCR Kit is ideally suited for:
• PCR for conventional sequencing (direct sequencing or sequencing of cloned PCR products)
• Next-generation sequencing library amplification (when used in conjunction with the KAPA Library Amplification protocol)
• Amplification of DNA fragments for cloning and protein expression or genomic characterization
• Site-directed mutagenesis.
For more information on these and other high-fidelity PCR applications, please refer to the KAPA HiFi Application Notes on Site-Directed Mutagenesis, Routine High-Fidelity PCR, and High-Fidelity GC-rich PCR available from www.kapabiosystems.com.

KAPA HiFi HotStart PCR 试剂盒非常适合:
• 用于常规测序的 PCR(直接测序或克隆 PCR 产物的测序)
• 下一代测序文库扩增(与 KAPA 文库扩增方案结合使用时)
• 用于克隆和蛋白质表达或基因组表征的 DNA 片段扩增
• 定点诱变。
有关这些和其他高保真 PCR 应用的更多信息,请参阅 www.kapabiosystems.com 上关于定点诱变、常规高保真 PCR 和高保真 GC-rich PCR 的 KAPA HiFi 应用说明。

Standard PCR Protocol

IMPORTANT! The KAPA HiFi HotStart ReadyMix contains an engineered B-family (proofreading) DNA polymerase and uniquely-formulated buffers, and requires specialized reaction conditions. If these conditions are not adhered to, reaction failure is likely. Refer to Important Parameters for more information.

Step 1: Prepare the PCR master mix
• KAPA HiFi HotStart reactions MUST be set up on ice since the high proofreading activity of the enzyme will result in rapid primer degradation at room temperature.
• Ensure that all reagents are properly thawed and mixed.
• Prepare a PCR master mix containing the appropriate volume of all reaction components common to all or a subset of reactions to be performed.
• Calculate the required volumes of each component based on the following table:

1 Reaction volumes may be adjusted between 10–50 μL. For volumes other than 25 μL, scale reagents proportionally. Reaction volumes > 50 μL are not recommended.
2 When using for next-generation sequencing library amplification, please use protocol provided with the KAPA Library Amplification Kit.
3 KAPA HiFi HotStart ReadyMix contains 2.5 mM MgCl2 (1X). Additional MgCl2 may be added separately, but is unlikely to be required.
4 KAPA HiFi HotStart ReadyMix contains 0.3 mM of each dNTP (1X), and 0.5 U of KAPA HiFi HotStart DNA Polymerase (per 25 μL reaction) in a proprietary reaction buffer.
Use < 100 ng genomic DNA (10–100 ng) and <1 ng less complex DNA (0.1–1 ng) per 25 μL reaction as first approach.

Step 2: Set up individual reactions
• Transfer the appropriate volumes of PCR master mix, template and primer to individual PCR tubes or wells of a PCR plate.
• Cap or seal individual reactions, mix and centrifuge briefly.

Step 3: Run the PCR
• Perform PCR with the following cycling protocol1:

1 When using for next-generation sequencing library amplification, please use protocol provided with the KAPA Library Amplification Kit.
2 Initial denaturation for 3 min at 95 °C is sufficient for most applications. Use 5 min at 95 °C for GC-rich targets (> 70% GC content).
3 KAPA HiFi HotStart ReadyMix has a higher salt concentration than conventional PCR ready-mixes, which affects DNA melting. To ensure that complex and GC rich targets are completely denatured, use a temperature of 98 °C for denaturation during cycling.
4 In addition to DNA melting, high salt also affects primer annealing. The optimal annealing temperature for a specific primer set is likely to be different (higher) than when used in a conventional PCR ready-mix. An annealing temperature gradient PCR is recommended to determine the optimal annealing temperature with the KAPA HiFi HotStart ReadyMix. If gradient PCR is not feasible, anneal at 65 °C as a first approach.
5 Two-step cycling protocols with a combined annealing/extension temperature in the range of 68–75 °C and a combined annealing/extension time of 30 sec/kb may be used.
6 Use 15 sec extension per cycle for targets ≤ 1 kb, and 30–60 sec/kb for longer fragments, or to improve yields.
7 For highest fidelity, use ≤ 25 cycles. In cases where very low template concentrations or low reaction efficiency results in low yields, 30–35 cycles may be performed to produce sufficient product for downstream applications.

Troubleshooting

 

Product Line KAPA Code Product Chinese Name Product Description Spec Rxn
HiFi & Lib Amp KK2101 KK2101 KAPA HiFi高保真酶+dNTPs (100反应) KAPA HiFi+dNTPs (100rxn) 100*50μL rxn/200*25μL rxn 100
HiFi & Lib Amp KK2102 KK2102 KAPA HiFi高保真酶+dNTPs (250反应) KAPA HiFi+dNTPs (250rxn) 250*50μL rxn/500*25μL rxn 250
HiFi & Lib Amp KK2501 KK2501 KAPA 热启动HiFi高保真酶+dNTPs (100反应) KAPA HiFi HotStart+dNTPs (100rxn) 100*50μL rxn/200*25μL rxn 100
HiFi & Lib Amp KK2502 KK2502 KAPA 热启动HiFi高保真酶+dNTPs (250反应) KAPA HiFi HotStart+dNTPs (250rxn) 250*50μL rxn/500*25μL rxn 250
HiFi & Lib Amp KK2601 KK2601 KAPA 热启动HiFi高保真酶预混液 (1.25mL) KAPA HiFi HotStart ReadyMix Kit (1.25mL) 1.25mL/50*50μL rxn/100*25μL rxn 50
HiFi & Lib Amp KK2602 KK2602 KAPA 热启动HiFi高保真酶预混液 (6.25mL) KAPA HiFi HotStart ReadyMix Kit (6.25mL) 6.25mL/250*50μL rxn/500*25μL rxn 250
HiFi & Lib Amp KK2631 KK2631 KAPA 热启动HiFi高保真酶预混液 (50mL) KAPA HiFi HotStart ReadyMix Kit (50mL) 50mL/2000*50μL rxn/4000*25μL rxn 2000
HiFi & Lib Amp KK2625 KK2625 KAPA 热启动HiFi高保真酶预混液 (50mL) v2 KAPA HiFi HotStart ReadyMix Kit (50mL) v2 50mL/2000*50μL rxn/4000*25μL rxn 2000
HiFi & Lib Amp KK2801 KK2801 KAPA Uracil+热启动HiFi高保真酶预混液 (1.25mL) KAPA HiFi HotStart Uracil+ ReadyMix Kit (1.25mL) 1.25mL/50*50μL rxn/100*25μL rxn 50
HiFi & Lib Amp KK2802 KK2802 KAPA Uracil+热启动HiFi高保真酶预混液 (6.25mL) KAPA HiFi HotStart Uracil+ ReadyMix Kit (6.25mL) 6.25mL/250*50μL rxn/500*25μL rxn 250

KAPA(KK8500, KK8502, KK8504)DNA HyperPrep文库构建试剂盒 (Illumina)

KAPA(KK8500, KK8502, KK8504)DNA HyperPrep文库构建试剂盒 (Illumina)

KAPA Hyper Prep KitIllumina平台
品牌: KAPA
规格: 8/24/96rxn
型号: KK8500/KK8502/KK8504

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KAPA HiFi高保真DNA聚合酶

KAPA HiFi高保真DNA聚合酶

上海金畔生物代理Kapa biosystems品牌产品,我们将竭诚为您服务,欢迎访问Kapa biosystems官网或者咨询我们获取更多相关Kapa biosystems品牌产品信息。

产品介绍

1、KAPA HiFi高保真酶是二代基因工程酶,分热启动版和非热启动版,保真性强,活力超高。具有以下特点:

1)超高保真,通过大规模二代测序得出的出错率:2.8×10-7

2)可以扩增各种复杂模板;

3)扩增片段长,扩增基因组可达15kb,质粒DNA或噬菌体DNA可达18kb;

4)扩增速度快,节省75%以上的时间;

5)KAPA高保真热启动酶,含有2中buffer,分别用于常规模板和高难度模板。

2、应用

1)基因定点突变;2)测序;3)蛋白表达。

3、产品表现

1)超级保真、灵敏

2)扩增复杂模板————无可匹敌

3)退火温度对条带特异性的重要性

4、PCR反应

1)推荐反应体系

2)推荐反应参数

注意事项:

1)HiFi Buffer中盐离子浓度较高,影响DNA变性/退火,所以复杂模板需要较长的起始变性温度,5min;GC Buffer主要针对高GC或含有稳定二级结构的模板,仅当HiFi Buffer效果不佳时使用,但其会降低保真性;

2)每个循环中变性条件为98℃ 20s;

3)最佳退火温度需通过梯度PCR优化得到;

4)推荐延伸时间:30s/kb;若模板浓度高,可降低延伸时间,但较长的延伸时间会增加实验的灵敏度和产量;

5)该体系可扩增≥10kb的目的基因片段。

6)根据实验要求可调整HiFi酶的浓度,范围0.25U-1.0U/25μl;

7)HiFi高保真酶扩增产物是平末端,若要连接到T载体上,扩增产物纯化后再进行加A。

5、问题及解决方案

相关产品

产品 货号 规格
KAPA HiFi+dNTPs KK2101、KK2102 100U、250U
KAPA HiFi HS+dNTPs KK2501、KK2502 100U、250U
KAPA HiFi HS RM KK2602 1.25ml 6.25ml

KAPA HyperPlus文库准备试剂盒-Illumina平台

  • KAPA HyperPlus文库准备试剂盒-Illumina平台

     KAPA Biosystems成立于2006年,是一家总部位于美国波士顿的高科技生物公司,致力于研发、生产下一代PCR(Next-GenerationPCR)所需要的基因工程酶,目前其分子进化平台开发的产品已经被广泛的应用于常规分子生物学、第二代基因测序、分子诊断、法医诊断等领域。KAPA Biosystems起步于常规分子生物学产品,但重点关注于NGS产品,如文库定量、各种文库制备、HiFi文库扩增等优势核心产品。

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    1)技术优势

    (1)HyperPlus提供 片段化+文库制备的解决方案

    (2)行业产品较高的文库产出量

    文库转化率(conversion rate)是指起始DNA转化成连接有接头、可以被测序的文库片段的百分比(%),是文库构建的重要评价指标,将最终决定文库的多样性和质量。

    KAPA HyperPlus试剂盒

    ●可取得最高至100%的文库转化率。

    ●对不同质量的DNA均有极佳的表现。

    ●高文库产出率,可允许进行DNA起始量低至50ng的PCR-free文库制备流程。

    (3)保证最好的测序结果

    ●高转化率,从而只需要较少的扩增循环,减少由扩增带来的重复率。

    ●保持文库的多样性,测序的覆盖度统一,从而检出低频突变的可信度高。

    (4)序列覆盖偏差极低

    ●与标记(tagmentation)和其他酶切片段DNA的方法相比,HyperPlus的酶切片段DNA模块的序列偏向性低。

    ●与机械碎片DNA的性能相同。

    ●由于其低序列偏向性,测序覆盖度更统一,从而降低测序费用。

    2、产品信息

    货号 产品 规格 说明书
    KK8510 KAPA HyperPlus文库构建

    (含酶切,含文库扩增)盒—Illumina

    8个文库
    KK8511 KAPA HyperPlus文库构建

    (含酶切,不含文库扩增)盒—Illumina

    8个文库
    KK8512 KAPA HyperPlus文库构建

    (含酶切,含文库扩增)盒—Illumina

    24个文库
    KK8513 KAPA HyperPlus文库构建

    (含酶切,不含文库扩增)盒—Illumina

    24个文库
    KK8514 KAPA HyperPlus文库构建

    (含酶切,含文库扩增)盒—Illumina

    96个文库
    KK8515 KAPA HyperPlus文库构建

    (含酶切,不含文库扩增)盒—Illumina

    96个文库
    KK8600 KAPA Frag Kit for  Enzymatic Fragmentation
    KAPA 酶切片断化试剂盒
    8反应
    KK8601 KAPA Frag Kit for  Enzymatic Fragmentation
    KAPA 酶切片断化试剂盒
    24反应
    KK8602 KAPA Frag Kit for  Enzymatic Fragmentation
    KAPA 酶切片断化试剂盒
    96反应

KAPA KK8602 Frag DNA酶切片段化试剂盒说明书

KAPA KK8602 Frag DNA酶切片段化试剂盒说明书
上海金畔生物代理Kapa biosystems品牌产品,我们将竭诚为您服务,欢迎访问Kapa biosystems官网或者咨询我们获取更多相关Kapa biosystems品牌产品信息。
用于酶促片段化的KAPA Frag试剂盒可对多种不同类型和起始量(1 ng -1 μg)的双链DNA(dsDNA)进行稳定可重复的酶促片段化,还可以整合入任何需要起始投入片段化dsDNA的NGS文库构建工作流程中。与机械性剪切不同,该流程不需要任何专门的设备或耗材,是由片段化时间和温度来控制。在功能上等同于通过Covaris片段化的DNA制备的文库。

适用说明:本说明书适用于货号为KK8600,KK8601及KK8602的产品。
友情提示:
1)本文档中的页码,附录均指原说明书中的页码及附录;
2)本文档包含原说明书中的产品描述,产品应用及实验操作流程等主要信息,欲了解关于本产品详细说明及信息,建议参考原说明书 (点击面板上“下载PDF”可下载)。

产品描述

用于酶促片段化的 KAPA Frag 试剂盒可对多种不同类型和起始量(1 ng – 1 μg)的双链 DNA(dsDNA) 进行稳定可重复的酶促片段化,还可以整合入任何需要起始投入片段化 dsDNA 的 NGS 文库构建工作流程中。

该工作流程可实现自动化,与机械性剪切不同,该流程不需要任何专门的设备或耗材。片段化的程度(DNA 片段的主峰大小和大小分布)是由片段化时间和温度来控制的。最佳的片段化参数在某种程度上取决于起始 DNA 的数量和性质,但 KAPA Frag 系统对 DNA 起始量和质量的灵敏度要低很多,因此比其他酶促片段化技术(包括标记)的可重复性更高。

使用 KAPA Frag 系统进行片段化的 DNA 生成的文库,在功能上等同于通过 Covaris 片段化的DNA 制备的文库。

产品应用

KAPA Frag 试剂盒非常适合于对用于NGS 文库构建的 dsDNA 进行低通量和高通量的片段化。它兼容高复杂度的基因组DNA,也兼容低复杂度样本,如小病毒基因组、质粒、cDNA 和长扩增子,以及低质量DNA,如 FFPE 样本片段化DNA 可用于不同的NGS 应用,包括:
● 全基因组鸟枪法测序
● 全外显子组测序或靶向测序, 使用 Roche SeqCap EZ、Agilent SureSelect、Illumina TruSeq、IDT xGen Lockdown™探针或其他杂交捕获系统
● 长扩增子的测序
● 选择的 RNA 测序应用。
KAPA DNA HyperPlus 文库构建试剂盒将结合KAPA Frag 和 KAPA HyperPrep 化学方法,在同一个试管中对您的样本进行片段化/文库构建的操作,可为您提 供 更 高 的 文 库 产 量 。 请 访 问www.sequencing.roche.com 获取更多信息。

片段化实验方法

  1. 酶促片段化
    如果DNA 样本含有 EDTA,则使用 KAPA 纯化磁珠进行基于 3X 磁珠的纯化,以在片段化之前去除EDTA。有关详细的DNA 纯化实验方法, 请参阅 KAPA 纯化磁珠(KAPA 纯化磁珠)技术数据表。

    或 者 , 准 备 足 够 体 积 的 适 当 稀 释 的Conditioning 溶液(每个DNA 样本准备 5 μL, 再加上过量的部分)。有关稀释 Conditioning 溶液的指导,请参阅表 2(第 4 页)。

    1.1
    参照如下方法,稀释用于文库构建的 dsDNA 量:
    ● 如果DNA 制剂不含 EDTA,则在 35 μL 的总体积中用 10 mM Tris-HCl(pH 8.0-8.5)进行稀释
    ● 如果DNA 制剂确实含有 EDTA,则在 30 μL 的总体积中,用含有 EDTA、且样本目前悬浮其中的缓冲液进行稀释。对每一个包含30 μL 含EDTA 的DNA 的反应,加入 5 μL 稀释的 Conditioning 溶液。
    1.2
    通过轻轻涡旋或上下移液进行混合
    1.3
    按以下顺序添加剩余组分,在冰上配制每一个片段化反应:

    * 可以将 KAPA 片段化缓冲液和酶预先混合,并在反应体系配制之前保存在冰上请注意,酶的体积大于此反应中的缓冲液体积。
    1.4
    轻轻涡旋并瞬时离心沉降。将 PCR 板/管放回冰上。立即继续下一步。
    1.5
    在 PCR 仪中进行孵育,预冷却至 4 °C,并按下述方法进行程序设置。将盖子的温度设置为 ≤ 50 °C。

    * 这些参数对于高质量基因组DNA 是一个不错的开始。有关如何优化片段化时间和温度的指南,参见反应优 化章节(第 5 页)。如果需要孵育时间的长度超过推荐范围,则样本可能会含有影响片段化效率的抑制剂。 建议在片段化之前进行基于磁珠的 DNA 纯化,而不是增加片段化的时间。

    1.6
    将反应转移至冰上,并立即添加 5 μL 终止液。轻轻涡旋,并直接进行片段化后纯化(步骤 2) 或片段化后片段选择(步骤 3)。
  2. 片段化后纯化
    2.1
    结合以下方法,进行一次基于磁珠的纯化:

    * 标准实验方法适用于 2X 的磁珠与 DNA 比率。有关更多详细信息以及有关如何修改纯化参数的指南,请参阅重要参数(第 3 – 4 页)。
    2.2
    通过涡旋和/或多次上下移液进行彻底混合。
    2.3
    将板/管在室温下孵育 5 – 15 分钟以将DNA 结合到磁珠上。
    2.4
    将板/管置于磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
    2.5
    小心吸出并丢弃上清液。
    2.6
    将板/管置于磁力架上,加入 200 μL 80%乙醇。
    2.7
    在室温下将板/管于磁力架上孵育 ≥ 30 秒。
    2.8
    小心吸出并丢弃上清液。
    2.9
    将板/管置于磁力架上,加入 200 μL 80%乙醇。
    2.10
    在室温下将板/管于磁力架上孵育≥30 秒。
    2.11
    小心吸出并丢弃上清液。在不影响磁珠的情况下,尝试去除所有残留的乙醇。
    2.12
    在室温下将磁珠干燥 3-5 分钟,或直至所有乙醇挥发。
    注意:过度干燥磁珠可能会导致产量降低。
    2.13
    从磁力架上取下板/管。
    2.14
    将磁珠重悬于适当体积的洗脱缓冲液(10 mM Tris-HCl,pH 8.0 – 8.5)中:
    ● 如果加入片段化的起始量在1 – 100 ng 的范围内,则重悬于 10 – 25 μL 的体积中。最小体积取决于所用磁力架的性质。
    ● 如果加入片段化的起始量 > 100 ng,则重悬于 30 – 55 μL 的体积中。
    2.15
    通过涡旋和/或上下移液进行彻底混合。
    2.16
    将板/管在室温下孵育 2 分钟以从磁珠上洗脱 DNA。
    2.17
    将板/管置于磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
    2.18

    将澄清的上清液转移到新的 PCR 板/管中。将片段化的文库在 2 ℃至 8 ℃下储存 1-2 周,或在-15 °C 至-25 °C 储存。

  3. 片段化后双侧片段选择
    为了获得片段化 DNA 的较窄片段分布,尤其是当片段化起始量 > 100 ng 时,和/或所需主峰片段长度超过 350 bp 时,在片段化后建议使用任何常用的片段选择技术(例如,此处介绍的双侧片段选择,或电泳法)。本章节中概述的双侧片段选择实验方法,是设计用于选择范围在 250 – 450 bp 的DNA 片段。为了获得更短或更长的片段,可以按照如下方式修改实验方法:


    * 第二次片段分离应使用至少 0.2 个体积的 AMPure XP。

    请注意,第二次分离所需的 KAPA 纯化磁珠的体积是相对于片段选择过程开始时的 DNA 体积计算得来的,而不是第一次分离后转移的含 DNA 上清液的体积。如果第一次和第二次分离之间的差异小于~0.2 个体积,则 DNA 回收量显著降低。为了增加 DNA 回收量,可以使用> 0.2 体积的 KAPA 纯化磁珠用于第二次分离,但是注意这可能导致文库片段回收偏小和 /或片段大小分布更宽。

    有关双侧片段选择的更多信息,请参阅 KAPA NGS 文 库 制 备 技 术 指 南 , 或 通 过 sequencing.roche.com/support 联系技术支持。

    3.1
    结合下述方法,进行第一次(0.6X)片段大小分离(以去除大于~450 bp 的片段):
    3.2
    通过涡旋和/或多次上下移液进行彻底混合。
    3.3
    将板/管在室温下孵育 5 – 15 分钟,以将大于~450 bp 的 DNA 片段结合到磁珠上。
    3.4
    将板/管置于磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
    3.5
    仔细地将含有小于~450 bp 的 DNA 片段的 85 μL 上清液移液到新的板/管中。
    重要的是,不要将磁珠与上清液一起转移。如果板/管中的磁珠结合了大于~450 bp 的DNA 片段,则丢弃这部分板/管。
    3.6
    结合下述方法进行第二次片段分离(0.8X,以保留 > 250 bp 的片段):
    3.7
    通过涡旋和/或多次上下移液进行彻底混合。
    3.8
    将板/管在室温下孵育 5 – 15 分钟,以将大于 ~ 250 bp 的 DNA 片段结合到磁珠上。
    3.9
    将板/管置于磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
    3.10
    仔细地去除并丢弃含有小于~ 250 bp 的 DNA 片段的上清液。
    3.11
    将板/管置于磁力架上,加入 200 μL 80%乙醇。
    3.12
    在室温下将板/管于磁力架上孵育 ≥ 30 秒。
    3.13
    小心吸出并丢弃上清液。
    3.14
    将板/管置于磁力架上,加入 200 μL 80%乙醇。
    3.15
    在室温下将板/管于磁力架上孵育 ≥ 30 秒。
    3.16
    小心吸出并丢弃上清液。在不影响磁珠的情况下,尝试去除所有残留的乙醇。
    3.17
    在室温下将磁珠干燥 3-5 分钟,或直至所有乙醇挥发。
    注意:过度干燥磁珠可能会导致产量降低。
    3.18
    从磁力架上取下板/管。
    3.19
    将磁珠彻底重悬于所需体积的洗脱缓冲液(10 mM Tris-HCl,pH 8.0-8.5)。
    3.20
    将板/管在室温下孵育 2 分钟以从磁珠上洗脱DNA。
    3.21
    将板/管置于磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
    3.22
    将进行了片段选择的DNA 转移到新的板/管中, 并将 DNA 在 2 °C 至 8 °C 下保存 1 至 2 周,或保存在-15 °C 至-25 °C。

KAPA KK8601 KAPA DNA酶切片段化试剂盒 24反应

KAPA KK8601 KAPA DNA酶切片段化试剂盒 24反应

片段化酶 KAPA代理,KAPAKK8601,KAPA KK8601 Library Preparation-Illumina  片段化酶

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KAPA KK8002磁珠 KAPA KK8002 Pure Beads 60ml

KAPA KK8002磁珠 KAPA KK8002 Pure Beads 60ml

产品型号:KK8002

简单介绍:KAPA公司 KAPA Pure Beads (60mL)磁珠销售代理KK8002 KAPA Pure Beads (60mL)磁珠 KAPA KK8002 KAPA Pure Beads (60mL)磁珠 KK8002,KAPA代理,KAPAKK8002,KAPA

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KAPA KK8001纯化磁珠 KAPA Pure Beads 30ml使用说明

KAPA KK8001纯化磁珠 KAPA Pure Beads 30ml使用说明
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KAPA KK8001纯化磁珠 KAPA Pure Beads 30ml使用说明

产品介绍

1、产品应用

1)快速、有效进行反应后纯化,去除二代测序文库准备、PCR及qPCR流程中的接头、接头自连产物、引物、引物

二聚体、核苷酸、盐离子和酶;

2) 能有效对二代测序流程中的起始片段化DNA、接头连接文库分子和扩增后的文库进行片段选择;

3)DNA样本的常规操作,如浓缩样本,更换样本中的缓冲液等。

2、产品优势

1) 单链或双链DNA(1ng-5µg)单次纯化中的高回收率;

2) 快速、有效的纯化,去除不需要的反应成分;

3)在基于磁珠的工作流程中可以取代原有磁珠;

4)可调节的片段选择;

5)可以进行自动化操作。

3、产品表现

(1)NGS流程中的完美融合:兼容KAPA所有DNA和RNA文库构建流程,与Agencourt® AMPure® XP相比,具有同样的性能,有同样的片段分布及回收效率,能够融入已存在的自动化应用中。
(A)KAPA HyperPlus Kit构建文库,起始于100ng高质量的 E. coli 基因组DNA,37℃ 孵育30分钟进行片段化,得到目标文库片段大小为300bp。

(B)利用KAPA Stranded RNA-Seq Kit with RiboErase进行文库构建,按照标准流程,起始于100ng UHR RNA。文库的产量是在接头连接后由KAPA Library Quantification Kit定量的。所有文库的电泳图谱都是由2100 High Sensitivity DNA Kit产出的。

(2)可调节、高度可重复性的片段选择获得一致的文库片段分布在文库构建中,各步骤都可灵活操作调节片段选择参数获得期望的文库片段。
KAPA纯化磁珠可以实现最终文库片段分布的高度可重复性。所有文库都始于1µg高质量的E. coli 基因组DNA,在适当的条件下,由超声DNA破碎仪E220选取适当的片段长度模式进行片段化处理,得到350-450bp长度,利用KAPA Hyper Prep Kit进行文库构建。在文库扩增(2个循环)后,利用KAPA纯化磁珠或Agencourt® AMPure® XP进行片段选择(0.6X-0.8X)。电泳图由 PerkinElmer® LabChip GX DNA High Sensitivity Assay产生。
在文库构建的各步骤中都可以进行片段选择的调整。C图是基因组DNA片段化后和接头连接后进行片段选择,可以得到相同片段分布的文库。D图是接头连接后,通过不同的片段选择参数所获得的不同的文库片段分布。所有的文库都起始于100ng高质量DNA,在适当的条件下,由超声DNA破碎仪E220选取适当的片段长度模式进行片段化处理,得到350-450bp长度,利用KAPA Hyper Prep Kit进行文库构建。电泳图由 PerkinElmer® LabChip GX DNA High Sensitivity Assay产生。

KAPA KK8000磁珠 KAPA Pure Beads  5ml

KAPA KK8000磁珠 KAPA Pure Beads  5ml

KAPA公司 KAPA Pure Beads磁珠销售代理、KK8000 KAPA Pure Beads 磁珠、 KAPA KK8000、 KAPA KK8001,KAPA KK8002代理
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KAPA Biosystems是一家美国知名生物公司,成立于2006年,其生产基地位于南非开普敦。KAPA Biosystems致力于研发、生产下一代PCR(Next-Generation PCR)所需的生物酶。目前其分子进化平台开发的产品已被广泛应用于DNA扩增、二代测序、分子诊断等领域。
目前大部分生物化学实验、科学研究主要应用较初级的生物酶,因受到这些酶本身特性的限制而无法更好地开展工作。近年来酶分子进化技术的出现,可专为某些特定的实验量身定制特定的生物酶。分子进化技术(酶工程)打破了现有的研究局限,为生物研究开创了一片新天地。
KAPA Biosystems技术团队在蛋白质工程、基因组学、蛋白质组学、合成生物学方面获得非常突出的成绩。
KAPA Biosystems公司追求科学研究与市场化运作的完美结合,执着于“科技创造完美产品,助力生命科学研究”这一宗旨。

产品优势

样品类型灵活,兼容微量、FFPE等在内的多种类型的临床样本。

文库转化率高,PCR 扩增循环数少,降低文库重复率,提高丰富度。

高性能的HIFI 酶有效降低了扩增偏差,可均匀覆盖GC复杂区域。

实验流程快速简便,手动步骤少,一致性和重现性好。

可匹配各种自动化工作站,方便融入不同的实验流程。

常备货号

品牌 货号 产品名称 规格
KAPA KK2502 HiFiHot Start 250 units
KAPA KK2602 KAPA 热启动HiFi

高保真酶 ReadyMix

6.25ml
KAPA KK2801 KAPAHiFiHotStart Uracil+ ReadyMix (1 x 1.25 mL) 50 x 50 μL reactions
KAPA KK5516 KAPA 2G Robust HotStart PCR Kit with dNTPs 250 U
KAPA KK5802 KAPA 2G Fast MultiplexPCR Kitz9试剂 500 x 25 μl rxns
KAPA KK8002 KAPA 纯化磁珠 (60ml) 60ml
KAPA KK8504 KAPA Hyper Prep (96rxn) 96rxn
KAPA Kk8514 KAPA DNA  HyperPlus文库构建试剂盒 (96个反应) 96rxn

KAPA KK8602片段化酶 Library Preparation – Illumina 96 rxn

KAPA KK8602片段化酶 Library Preparation – Illumina 96 rxn
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第二代基因工程酶
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KAPA 2G Robust DNA聚合酶
KAPA 2G快速DNA聚合酶
KAPA 长片段DNA聚合酶
二代测序相关产品
KAPA HiFi高保真二代测序文库扩增试剂
KAPA HiFi高保真甲基化文库扩增试剂
KAPA Hyper文库准备试剂盒
直接扩增、DNA快速提取相关产品
KAPA 血液直接扩增试剂盒
KAPA DNA快速提取试剂盒

KAPA KK8601片段化酶 Library Preparation – Illumina

KAPA KK8601片段化酶 Library Preparation – Illumina

规格:24 rxn
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第二代基因工程酶
KAPA HiFi高保真DNA聚合酶
KAPA 2G Robust DNA聚合酶
KAPA 2G快速DNA聚合酶
KAPA 长片段DNA聚合酶
二代测序相关产品
KAPA HiFi高保真二代测序文库扩增试剂
KAPA HiFi高保真甲基化文库扩增试剂
KAPA Hyper文库准备试剂盒
直接扩增、DNA快速提取相关产品
KAPA 血液直接扩增试剂盒
KAPA DNA快速提取试剂盒

KAPA KK8600片段化酶 Library Preparation – Illumina

KAPA KK8600片段化酶 Library Preparation – Illumina

规格:8 rxn
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荧光定量相关试剂
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KAPA探针超强定量试剂
第二代基因工程酶
KAPA HiFi高保真DNA聚合酶
KAPA 2G Robust DNA聚合酶
KAPA 2G快速DNA聚合酶
KAPA 长片段DNA聚合酶
二代测序相关产品
KAPA HiFi高保真二代测序文库扩增试剂
KAPA HiFi高保真甲基化文库扩增试剂
KAPA Hyper文库准备试剂盒
直接扩增、DNA快速提取相关产品
KAPA 血液直接扩增试剂盒
KAPA DNA快速提取试剂盒

KAPA PKA1012 单一品种 PKA1012 Truseq Adapter index12

KAPA PKA1012单一品种 PKA1012 Truseq Adapter index12

规格:30uM*20ul
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KAPA 2G Robust DNA聚合酶
KAPA 2G快速DNA聚合酶
KAPA 长片段DNA聚合酶
二代测序相关产品
KAPA HiFi高保真二代测序文库扩增试剂
KAPA HiFi高保真甲基化文库扩增试剂
KAPA Hyper文库准备试剂盒
直接扩增、DNA快速提取相关产品
KAPA 血液直接扩增试剂盒
KAPA DNA快速提取试剂盒

KAPA PKA1011 单一品种 Truseq Adapter index11

KAPA PKA1011 单一品种 Truseq Adapter index11

规格:30uM*20ul
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荧光定量相关试剂
KAPA SYBR FAST qPCR 试剂盒
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第二代基因工程酶
KAPA HiFi高保真DNA聚合酶
KAPA 2G Robust DNA聚合酶
KAPA 2G快速DNA聚合酶
KAPA 长片段DNA聚合酶
二代测序相关产品
KAPA HiFi高保真二代测序文库扩增试剂
KAPA HiFi高保真甲基化文库扩增试剂
KAPA Hyper文库准备试剂盒
直接扩增、DNA快速提取相关产品
KAPA 血液直接扩增试剂盒
KAPA DNA快速提取试剂盒

KAPA PKA1010 Truseq Adapter index10

KAPA PKA1010 Truseq Adapter index10

规格:30uM*20ul

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KAPA 2G快速DNA聚合酶
KAPA 长片段DNA聚合酶
二代测序相关产品
KAPA HiFi高保真二代测序文库扩增试剂
KAPA HiFi高保真甲基化文库扩增试剂
KAPA Hyper文库准备试剂盒
直接扩增、DNA快速提取相关产品
KAPA 血液直接扩增试剂盒
KAPA DNA快速提取试剂盒

KAPA PKA1009单一品种 PKA1009 Truseq Adapter index9

KAPA PKA1009单一品种 PKA1009 Truseq Adapter index9

规格:30uM*20ul
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第二代基因工程酶
KAPA HiFi高保真DNA聚合酶
KAPA 2G Robust DNA聚合酶
KAPA 2G快速DNA聚合酶
KAPA 长片段DNA聚合酶
二代测序相关产品
KAPA HiFi高保真二代测序文库扩增试剂
KAPA HiFi高保真甲基化文库扩增试剂
KAPA Hyper文库准备试剂盒
直接扩增、DNA快速提取相关产品
KAPA 血液直接扩增试剂盒
KAPA DNA快速提取试剂盒

KAPA PKA1008单一品种 Truseq Adapter index8

KAPA PKA1008单一品种 Truseq Adapter index8

规格:30uM*20ul
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荧光定量相关试剂
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KAPA HiFi高保真甲基化文库扩增试剂
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直接扩增、DNA快速提取相关产品
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KAPA DNA快速提取试剂盒

KAPA PKA1007 单一品种 Truseq Adapter index7

KAPA PKA1007 单一品种 Truseq Adapter index7

规格:30uM*20ul
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KAPA 2G Robust DNA聚合酶
KAPA 2G快速DNA聚合酶
KAPA 长片段DNA聚合酶
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