激酶分析筛选试剂盒
Fluorospark® Kinase/ADP Multi-Assay Kit
Fluorospark® Kinase/ADP Multi-Assay Kit 是富士胶片和光与日本东京大学新药研究机构共同研发的 ADP 荧光检测试剂盒。拥有高通量筛选（HTS）所必须的高灵敏度、高准确度、低成本、简便等特性。本产品不仅可检测激酶，同时可用于检测产生 ADP 的酶（如 ATP 酶、乙酰基— CoA 羧化酶）的活性。
◆原理
本试剂盒通过酶偶联反应简单、高灵敏度的定量检测 ADP 。通过激酶反应产生的 ADP 用红色荧光物质试卤灵定量。
◆优点、特色
● 适合终点（endpoint）和实时实验
● 优异的 Z’-factor 数据（数据差异小）
● 高灵敏度检测 ADP 量
● 检测直到 ADP 30 μmol/L 仍可保持线性关系
● 一步反应，检测时间短（~30分钟）
● 成本较低
与传统方法（发光）比较
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试剂名称
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Fluorospark® Kinase
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传统发光法（Ａ公司）
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原理
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ADP 定量（荧光）
（直接定量生成的 ADP）
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ADP 定量（发光）
（需要把生成的 ADP 变换成 ATP 再定量）
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操作顺序
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１步
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２步
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所需时间
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30 分钟
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70~100 分钟
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ADP 定量范围
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~30 μmol/L
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~1 mmol/L
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价格
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低成本
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高成本
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优点
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Z’-factor 数值高
适合实时、终点反应
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动态范围大
S/B 比高
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◆试剂盒组成
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No. 试剂
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用途
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1,000次
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底物液
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2×制备检测液
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9 mL
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酶液
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500 μL
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刃天青液
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100 μL
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还原封闭剂
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400 μL
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D 终止液
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停止偶联反应
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10 mL
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10 mmol/L ATP 溶液
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激酶反应，制作标准曲线
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100 μL
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10 mmol/L ADP 溶液
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制作标准曲线
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100 μL
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◆案例、应用
【实验流程（终点（endpoint）法）】
激酶反应液里添加等量的2×检测液（使用时制备）即可检测激酶活性
【制作 ADP 标准曲线】
用 0、10、20、30 μmol/L ADP 制作标准曲线。
良好的线性关系可定量最多至 30 μmol/L 的 ADP。
【低浓度 ADP 区域里定量】
制作各 ATP/ADP 浓度（ATP+ADP=1,10,100 μmol/L）里底物变换率 0-10% 标准曲线
ATP/ADP标准曲线里底物变换率低（=ADP浓度低）时线性关系依然较好
【荧光信号的稳定性】
20 μmol/L ADP 和 2x检测液混合，在30分钟~7小时候检测荧光强度。30分钟后的荧光强度标准化为100%，相关变动表格如下。
ADP和2×检测液混合后，在30分~7小时内的荧光信号十分稳定。
【数据：Z’-factor 实测值】
定量与各 ATP/ADP 浓度（ATP+ADP=1,10,100 μmol/L），5%底物变换率相当的 ADP 时，本试剂盒方法与传统发光法的 Z’-factor 比较。
Z’-factor：Fluorospark® Kinase >传统发光法（Ａ公司）
在各ATP浓度里，5%低底物变换率也有优异的 Z’-factor。
什么是 Z’-facotr
Z’-facotr 是一个关于信号区间和变异的组合，它已成为评估测试方法质量的主要参数。使用 Z’-factor = 1 – (3×SDH + 3×SDL)/(AvH-AvL) 公式计算（SDH 和 SDL 为阳性对照和阴性对照的方差，AVH 和 AVL 为阳性对照和阴性对照的平均值）。
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Z-factor
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Interpretation
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1.0
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理想情况下等于 1.0。Z factor 永远不可能超过 1.0。
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0.5 – 1.0之间
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较好的实验。
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0 – 0.5 之间
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临界的实验（较差的实验）。
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小于0
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阳性对照和阴性对照的数值有很多重叠。
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【制作抑制曲线】
制作 cAMP- 依赖性蛋白激酶（PKA）抑制剂 H-89 的抑制曲线
（PKA 0.02 U/μL，ATP 5 μmol/L，Kemptide 125 μg/mL 及各浓度的 H-89）
Fluorospark® Kinase 与传统发光法（Ａ公司）有几乎相同的 IC50 值。
（本方法得到的 H-89 IC50值与文献值*（IC50=40nmol/L）几乎相同）
* Hidaka, H. et al., Methods Enzymol., 201, 328-39(1991).
【实验流程（实时法）】
通过实时检测荧光强度，实时检测激酶活性。
【ADP 定量反应时间的比较（实时检测）】
对各浓度 ADP［ADP=0, 0.25, 0.5, 1, 2 μmol/L（ATP+ADP=10 μmol/L）］进行实时检测。
Fluorospark® Kinase 在约十分钟内完成 ADP 定量反应。背景（ADP=0 μmol/L）信号稳定。
【实时检测添加 DTT 的影响】
ADP=2 μmol/L（ATP+ADP=10 μmol/L）里添加还原剂 DTT（0.1、1 mmol/L），进行实时检测。
Fluorospark® Kinase在约十分钟内完成ADP定量反应。即使DTT浓度增高，结果依然稳定。
【通过实时检测计算 PKA 的 Km（ATP）值】
在各种 ATP 浓度下通过实时检测计算出 PKA 反应速度，并求取 ATP 的 PKA（Km 值）。
（PKa 0.02 U，各浓度的 ATP 及 Kemptide 100 μg/mL）
根据实时检测进行酶的动力学分析。
（本方法得到的 Km 值与文献值**（3~15 μmol/L）几乎相同）
** Flockhart, D.A. and Corbin, J.D., CRC Crit. Rev. Biochem., 12, 133-86(1982).
