固体和液体LB培养基配方,SURE Chemically Competent Cell 大肠杆菌化学感受态细胞

SURE;SURE-2;Stbl3;Stable;Direct repeats 正向重复片段;Retroviral sequences 逆转录病毒序列;Stratagene;

产品名称 规格
SURE Chemically Competent Cell大肠杆菌化学感受态细胞 10×100μl
SURE Chemically Competent Cell大肠杆菌化学感受态细胞 50×100μl

产品组分:

组分编号 组分名称

货号(规格)

1000UL    5000UL   
A    SURE Competent Cell 10×100μl 50×100μl
B Control Vector puC19, 10 pg/µl      10μl 10μl

菌株描述

SURE菌株是Agilent (Stratagene)公司开发,特别设计用于克隆在传统的大肠杆菌菌株中“无法克隆”的某些DNA片段。SURE菌株破坏了重组酶系统整条通路上的组分,这些组分能催化重组和删除体内的非标准二级和三级结构,包括十字形(由反向重复序列引起)和Z字形的DNA,经常出现在真核生物DNA中,能阻止真核DNA克隆进入传统大肠杆菌菌株中。SURE含限制缺陷(McrA-, McrCB-, McrF-, Mrr-, HsdR-),使其无法对外源DNA进行标记和限制,从而提高外源甲基化DNA的克隆效率。也含内切酶缺陷(endA),和重组缺陷(recB recJ),提高了外源DNA的稳定性。存在于F´因子上的lacIqZΔM15使菌株适用于蓝白斑。菌株本身含卡那霉素(KanR)和四环素(TetR)特性。

SURE菌株基因型:e14-(McrA-) Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)171 endA1 gyrA96 thi-1 supE44 relA1 lac recB recJ sbcC umuC::Tn5 (Kanr) uvrC [F´ proAB lacIqZΔM15 Tn10 (Tetr)].

产品描述

本品是SURE菌株经特殊工艺制作所得的感受态细胞,可用于DNA的热击转化。经pUC19质粒检测转化效率>5×108 cfu/μg DNA。且在-80℃能稳定保存几个月转化效率不发生改变。

保存与运输条件:

保存:-80℃保存,六个月有效。

运输:干冰运输。

注意事项

1)   感受态细胞必须用干冰运输。感受态细胞应在-80℃保存,不可反复冻融且放置时间过长,否则会减低感受态细胞的转化效率。

2)   最好在冰上融化感受态细胞。

3)   进行转化操作时,需在相应温度及无菌条件下进行。

4)   转化高浓度质粒或高效率连接产物可相应降低最终用于涂板的菌量。

5)   菌株本身含卡那霉素和四环素特性,携带此两种抗性的质粒不适合克隆到SURE细胞。当携带抗霉素抗性基因(CamR)的质粒转化进入SURE细胞,使用添加100μg/ml氯霉素的LB固体平板来筛选克隆子。SURE细胞本身能耐受<40μg/ml氯霉素,但对100μg/ml 氯霉素很敏感。

6)   为防止转化实验不成功,可保留部分连接反应液以重新转化,将损失降到最低。

7)   采用常规操作流程转化SURE感受态细胞,转化效率可达5×108 cfu/μg DNA。若是对转化效率要求更高,可使用标准操作流程。

8)   产品包装内含质粒pUC19 DNA(10 pg/μl),供对照实验用。

9)   为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

常规操作流程【所有操作均在无菌条件的标准下进行】

1)   从-80℃取出感受态细胞迅速置于冰浴中5min使其完全融化。

2)   向融化的感受态细胞中加入目的DNA(根据实际情况加入适量的DNA,通常100 μl感受态细胞能够被1 ng超螺旋质粒DNA所饱和),用手轻弹混匀(避免用移液枪上下吹打),冰浴静置25-30min。

3)   42℃热击45s,迅速将离心管转移到冰浴中,冰上静置2-3min。此过程不要摇动离心管。

4)  向每个离心管中加入900 μl无菌的2YT或LB培养基(不含抗生素),混匀后置于37℃ 摇床,200 rpm振荡培养60min,目的使质粒上相关的抗性标记基因表达,使菌体复苏。

5)  5000rpm离心1min,吸走900 μl上清,留取100μl左右轻轻吹打重悬菌体,加到含相应抗生素的2YT或LB固体琼脂培养基上,用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开,将平板置于室温(或37℃)直至液体被吸收,倒置培养,37℃过夜培养。

【注意】:a)涂布用量可根据具体实验调整。若转化的DNA总量较多,可取少量转化产物涂布平板;反之,若转化的DNA总量较少,可将所有转化产物涂布平板。b)新制备的固体培养基不易涂干,可将平板正置于37℃直至液体被吸收后再倒置培养。c)涂布剩余的菌液可置于4℃保存,如果次日的转化菌落数过少,可以将剩下的菌液再涂布新培养基进行培养。

标准操作流程【所有操作均在无菌条件的标准下进行】

1)   冰上提前预冷14ml BD Falcon聚丙烯圆底离心管, 42℃预热SOC培养基。

2)   从-80℃取出感受态细胞迅速置于冰浴中5min使其完全融化。用手轻弹混匀吸取100 μl细胞到预冷的14ml离心管内。

3)   加1.7μl β-ME(1.42M)到细胞内。【β-ME能提高转化效率】

4)   轻弹管子。置于冰上孵育10min,每2min轻弹混匀细胞一次。

5)   往细胞内加入0.1-50ng目的DNA,轻弹混匀细胞,冰上静置孵育30min。

6)   42℃热激45s,热激过程的持续性非常重要。冰上静置2min,此过程不要摇动离心管。

6)  向每个离心管中加入900 μl预热的无菌SOC培养基(不含抗生素),混匀后置于37℃ 摇床,225-250 rpm振荡培养60min,目的使质粒上相关的抗性标记基因表达,使菌体复苏。

7)  吸取≤200 µl 转化菌液,加到含相应抗生素的LB固体琼脂培养基上(若需要颜色反应,平板含IPTG+ X-gal),用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开,将平板置于室温(或37℃)直至液体被吸收,倒置培养,37℃过夜培养。【注意:若是进行蓝白斑筛选,37℃至少培养17h,使得颜色能生成。另外将平板置于4℃孵育2h,能加强颜色反应。】

附表1 固体和液体LB培养基配方

组分Component LB(液体)/升      LB(固体)/升   
胰蛋白胨Tryptone 10g 10g
酵母提取物Yeast extract       5g 5g
氯化钠NaCl 10g 10g
1N NaOH 调整pH至7.0 调整pH至7.0
琼脂Agar / 15g

附表2 固体和液体2-YT培养基配方

组分Component 2YT(液体)/升     2YT(固体)/升   
胰蛋白胨Tryptone 16g 16g
酵母提取物Yeast extract    10g 10g
NaCl 5g 5g
1N NaOH 调整pH至7.0 调整pH至7.0
琼脂Agar / 15g