Rhod-2, AM, Cell Permeant 钙离子荧光探针,超级纯 HTS Screen Assay 高通量筛选

Rhod-2 AM Cell Permeant 钙离子荧光探针;Rhod-4, AM;Fluo-8; Fluo-4; HTS Screen Assay 高通量筛选;

订购信息:

产品名称 产品编号 规格
Rhod-2, AM, Cell Permeant 钙离子荧光探针,超级纯 MX4507-50UG 50μg
Rhod-2, AM, Cell Permeant 钙离子荧光探针,超级纯 MX4507-250UG 5×50μg

产品描述

Rhod-2是一种高亲和力的可见光激发波长Ca2+荧光探针。类似于Fluo-3或Fluo-4,其激发和发射光谱不会随着Ca2+浓度变化发生明显的迁移,荧光信号一旦与Ca2+结合后明显增强。不同于Fluo-3或Fluo-4,Rhod-2的波长更长(Ex/Em=549/578 nm),这一特性使其更适合具高水平自荧光信号细胞或组织的Ca2+水平检测,还可用来检测由光感受器和笼锁Ca2+螯合剂光激活导致的Ca2+释放。

Rhod-2, AM是Rhod-2的一种乙酰甲酯衍生物,具有细胞膜渗透性,只需简单培养,即可轻易进入细胞。一旦进入细胞内,即被其内酯酶剪切生成不具膜渗透性的Rhod-2,从而滞留在胞内以发挥相应生理功能。本品以冻干粉的形式提供,使用时只需经无水DMSO充分溶解,配置成2~5mM的储存液,并依据具体实验和相关文献资料调整到需要的工作浓度即可。

主要特征:

1) 长波长钙离子探针,能够与GFP和绿色荧光探针兼容;

2) 特别定位在线粒体。以罗丹明结构为基础的Rhod-2 AM带正电荷,以电位驱动的方式吸收聚集在线粒体,荧光显微镜下观察加载进入细胞呈现点状染色模式。有文献认为,Rhod-2是线粒体Ca2+的选择性探针,不过这一理论并未得到广泛支持。

3) 检测平台:荧光成像,流式细胞术,酶标仪,高内涵筛选(HCS)

基本特性:

1) CAS NO:129787-64-0

2) 化学名:9-[4-[bis[2-[(acetyloxy)methoxy]-2-oxoethyl]amino]-3-[2-[2-[bis[2-[(acetyloxy)methoxy]-2-oxoethyl]amino]phenoxy]ethoxy]phenyl]-3,6-bis(dimethylamino)-xanthylium, monobromide

3) 同义名:Rhod-2, Acetoxymethyl Ester

4) 分子式:C52H59N4O19Br

5) 分子量:1123.96

6) 外观:红色固体

7) 最大激发/发射波长:549/578 nm

8) Kd(Ca2+结合):570NM

9) 溶解性:溶于DMSO(2~5mM)

10)化学结构式:

保存与运输方法

保存:-20℃干燥避光保存,至少一年有效。

运输:室温运输。

注意事项

1) 荧光染料均存在淬灭问题,请尽量注意避光,以减缓荧光淬灭。

2) Rhod-2从低浓度Ca2+到高浓度Ca2+的荧光增强程度低于Fluo-3,另外,Rhod-2的荧光信号弱于Fluo-3。

3) 乙酰氧基甲基酯(AM)易吸潮,冰箱取出后请在干燥的环境放至室温后再开封。由于试剂微量,开封前请将其短暂离心,以保证粉末落入管底。

4) Rhod-2, AM在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内,可在20-25℃温育片刻至全部融解后使用。

5) Rhod-2, AM第一次使用,建议储存液现配现用,分装成单次用量,严格做到≤-20℃密封干燥冻存,以防止受潮。为了保证良好的实验效果,尽量在短时间内使用。

6) 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

【注意】以下使用方法仅用作参考,可根据具体的实验条件做出调整。

A, 试剂准备

1) 配制Pluronic F-127母液:称取100mg Pluronic F-127粉末(货号:MS4301-1G)中加入500μl DMSO,配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解过程需要在40-50℃加热20-30min。溶液室温保存,不用冷藏。如有结晶析出,可以重新加热后溶解,不影响使用。

2) HHBS Buffer(1X Hank’s Balanced Salt Solution with 20mM HEPES buffer, pH 7.3) 或者其他生理缓冲液

B,操作步骤

1) 用无水DMSO溶解Rhod-2, AM配制成2-5mM的储存液,或将已配好的Rhod-2, AM储存液取出于室温回温。(如:若配制成4mM的母液,需向50µg Rhod-2, AM中加入11.1µl 无水DMSO)。准备Rhod-2, AM工作液之前,有时需要往Rhod-2, AM储存液中加入适量的20% Pluronic F-127溶液,以增强AM探针的水溶性。

【注①】:Rhod-2, AM染色工作液制备前,添加等体积20% Pluronic F-127溶液到Rhod-2, AM+DMSO储存液,从而使Pluronic F-127的最终工作浓度约为0.02%。

【注②】:Pluronic F-127可以防止AM探针在溶液中聚合并促使探针更好进入细胞。但Pluronic F-127可降低AM探针的稳定性,因此只建议在配制工作液时加入,不建议加入储存液长期保存。

2) 用HHBS或其他生理缓冲液将 Rhod-2, AM+DMSO储存液稀释到1-10µM的工作液。

【注①】:Rhod-2,AM应用在大部分细胞的推荐加载浓度为4-5µM,具体的使用浓度需根据实验要求进行优化。为了避免过度加载造成细胞毒性,建议在取得有效结果的基础上尽量使用最低探针浓度。

【注②】:Rhod-2, AM工作液需现配现用,避免反复冻存。

3) 【可选】如果细胞内含有机阴离子转运体,丙磺舒(Probenecid,1-2.5mM)或磺吡酮(Sulfinpyrazone,0.1-0.25mM)可能需要加入细胞培养基内,以降低去酯化探针的泄露水平。

【注①】:丙磺舒或磺吡酮储存液相当偏碱,因此加入培养基后需要重新调整pH。

4) 将准备好的Rhod-2, AM工作液加入细胞,加入量以覆盖细胞为准。37℃孵育20min-2h。

【注①】:若使用含血清的培养基,血清内酯酶会降解AM,从而降低Rhod-2, AM加载效果。而含酚红培养基会使本底值略偏高,建议加入染色工作液前,对细胞清洗2~3次。

【注②】:关于孵育的时间,如果首次做实验不能确定,建议先孵育30min,看荧光效果;如果细胞死亡较多,适当缩短时间;如果荧光强度太弱,适当延长时间。

【注③】:降低探针加载温度可能会降低探针的区室化现象。

5) 吸掉染色工作液,并用HHBS或其他生理缓冲液(如有必要,使用含转运体抑制剂如2.5mM丙磺舒的缓冲液)清洗细胞1~2次,以去除残留探针。

6) 室温再孵育30min以保证细胞内AM的完全去酯化。

7) 用适当的仪器如激光共聚焦、流式细胞仪、荧光酶标仪,以及波长Ex/Em=549/578 nm来进行检测。

Rhod-2 AM的应用实例:

1) 应用目的:用Ca2+荧光探针Rhod-2 AM(MX4507-50UG)检测顺铂(cisplatin)敏感SKOV3细胞和顺铂耐性SKOV3/DDP细胞内线粒体Ca2+水平的变化。

Fig 1. 顺铂或ATP处理诱导SKOV3细胞线粒体Ca2+内流,并非SKOV3/DDP细胞。A)两种细胞系分别用ATP诱导处理,时间序列扫描检测线粒体Ca2+变化,通过共聚焦显微镜得到数据。B)细胞用6 μg/ml顺铂处理0h,8h和16h后用共聚焦显微镜检测(bar,20 μm)。

2) 应用目的:用Ca2+荧光探针Rhod-2 AM(MX4507-50UG)检测顺铂(cisplatin)对HeLa细胞线粒体Ca2+水平的变化。

Fig 2. 顺铂增加细胞浆和线粒体内游离Ca2+水平。A)HeLa细胞用顺铂(2.5, 5 or 10 µg/ml)处理0h,6h,12h和24h后,用荧光钙离子探针Fluo-4 AM孵育。细胞浆Ca2+浓度用共聚焦显微镜观察(bar,40 μm)。B)Fluo-4 AM定量检测细胞浆内游离Ca2+水平。C)HeLa细胞用顺铂(2.5, 5 or 10 µg/ml)处理0h,6h,12h和24h后,用荧光钙离子探针Rhod-2 AM孵育。线粒体Ca2+浓度用共聚焦显微镜观察(bar,40 μm)。D)Rhod-2 A定量检测线粒体内游离Ca2+水平。

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