OverExpress C43(DE3)pLysS Chemically Competent Cell 大肠杆菌化学感受态细胞

OverExpress C43(DE3)pLysS;OverExpress C43(DE3);BL21 (DE3);OverExpress C41(DE3);表达感受态细胞;毒性蛋白表达;pET表达载体;

货号 产品名称 规格
MF2482-1000UL OverExpress C43(DE3)pLysS Chemically Competent Cell大肠杆菌化学感受态细胞 10×100μl
MF2482-5000UL OverExpress C43(DE3)pLysS Chemically Competent Cell 大肠杆菌化学感受态细胞 50×100μl

 菌株描述

OverExpress C41(DE3)、C41(DE3) pLysS、C43(DE3)和C43(DE3) pLysS都是大肠杆菌(E. Coli)菌株,有效表达不同物种有机生物体包括细菌、酵母菌、植物、病毒和哺乳动物来源的毒性蛋白。

OverExpress菌株含赋予毒性蛋白抗性的遗传突变。C41(DE3)菌株来源于BL21(DE3),此菌株含一个突变,能降低T7 RNA聚合酶(T7 RNAP)的水平,从而预防许多重组毒性蛋白过表达引起的细胞死亡。C43(DE3)菌株来源于C41(DE3),通过筛选对另一个不同毒性蛋白的抗性菌株而获得。C43(DE3)与C41(DE3)菌株相比,至少携带另一个不同突变,使其获得更广泛更高的毒性蛋白耐受能力。

正如BL21(DE3)菌株,OverExpress C41(DE3)、C41(DE3) pLysS、C43(DE3)和C43(DE3) pLysS都含DE3区,所有菌株染色体上整合λ噬菌体DE3溶原体(其上携带lacUV5启动子调控的T7 RNA聚合酶基因),适用于靶基因克隆进入T7启动子表达载体比如pET系列的蛋白生产。

OverExpress C41(DE3) pLysS和C43(DE3) pLysS菌株携带pLysS质粒,具有氯霉素抗性,能够表达少量T7溶菌酶(一种天然的T7 RNA聚合酶抑制剂)。T7溶菌酶能作用于大肠杆菌细胞壁上的肽聚糖溶解大肠杆菌,降低目的基因的背景表达水平,但不会干扰IPTG诱导的表达,从而能够稳定重组表达的蛋白,特别是毒性蛋白。氯霉素(34 µg/ml)需加入菌株培养基内以维持pLysS质粒。

OverExpress C43(DE3) pLysS菌株基因型:F–ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm (DE3) pLysS (CmR)

产品描述

本品是大肠杆菌OverExpress C43(DE3) pLysS菌株经特殊工艺制作所得的感受态细胞,可用于DNA的热击转化。经pUC19质粒检测转化效率可达1×108 cfu/μg DNA。且在-80℃能稳定保存几个月转化效率不发生改变。

产品包装

组分编号 组分名 货号(规格)
MF2482-1000UL MF2482-5000UL
MF2482-A OverExpress C43(DE3)pLysS Competent Cell 10×100μl 50×100μl
MF2482-B Control Plasmid puC19,10pg/μl 10μl 10μl

保存与运输条件:

保存:-80℃保存,六个月有效。

运输:干冰运输。

注意事项

1) 感受态细胞必须用干冰运输,感受态细胞应在-80℃保存。

2) 感受态细胞最好在冰上融化,不可在冰上放置时间过长,长时间存放会降低转化效率。

3) 进行转化操作时,需在相应温度及无菌条件下进行。

4) 为防止转化实验不成功,可保留部分连接反应液以重新转化,将损失降到最低。

5) 产品包装内含质粒pUC19 DNA(10pg/μl),供对照实验用。

6) 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

7) 诱导时,IPTG浓度范围可选:0.1~2mM。

8) 为了得到足量的蛋白,需就最佳诱导时间、温度、IPTG浓度进行优化。

9) OverExpress C43(DE3) pLysS菌株携带pLysS质粒,除复苏培养基不含抗生素外,其他所用固体培养基、液体培养基均应添加34µg/ml氯霉素,以防质粒丢失。

10) 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法【所有操作均在无菌条件的标准下进行】

1) 从-80℃冰箱取出取感受态细胞,迅速置于冰浴中,5min后待菌块融化,加入目的DNA(质粒或连接产物),用手轻弹管底轻轻混匀(避免用枪吸打),冰浴静置25min。

2) 42℃水浴热激45s,迅速将离心管转移到冰浴中,冰上静置2min。此过程不要摇动离心管。

3) 向每个离心管中加700 μl无菌的LB培养基(不含抗生素),混匀后置于37℃摇床,200 rpm振荡培养60min,目的使质粒上相关的抗性标记基因表达,使菌体复苏。

4) 低速离心收菌(比如5000rpm,1min),留取50μl左右上清,用枪轻轻吹打重悬菌块,之后加到含34µg/ml氯霉素以及所选质粒筛选抗生素的LB固体琼脂培养基上,用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开,将平板置于室温(或37℃)直至液体被吸收,倒置培养,37℃培养过夜。

【注意】:

a)涂布用量可根据具体实验调整。若转化的DNA总量较多,可不用离心,直接取少量转化产物涂布平板;反之,若转化的DNA总量较少,则通过离心(5000 rpm,1min)后吸除部分培养液,悬浮菌体后将其涂布于一个平板中。

b)新制备的固体培养基不易涂干,可将平板正置于37℃直至液体被吸收后再倒置培养。

c)涂布剩余的菌液可置于4℃保存,如果次日的转化菌落数过少,可以将剩下的菌液再涂布新培养基进行培养。

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附录I 蛋白诱导步骤(仅作参考)

1)从新鲜涂布平板上挑取一单克隆,转移到含相应抗生素的5ml LB液体培养基内。需注意对于OverExpress pLysS菌株,除筛选抗生素之外还要加入氯霉素(34 µg/ml)。

2)37℃,200rpm摇菌培养过液。为了最小化诱导前目的蛋白的最小化表达,添加葡萄糖(终浓度为0.2% w/v)到生长培养基内。

3)将步骤2)中过夜培养的菌液吸取0.5ml接种到含相应抗生素的50ml LB液体培养基内(建议使用500ml三角瓶培养)。

4)37℃,150rpm摇菌培养直至OD600达到0.6~0.8(建议0.6,约2.5h)。

 

5)【可选】用移液枪吸取1ml培养物到干净的离心管内,置于冰上直至用于凝胶分析或保存在-20℃。这是非诱导的对照样本。

5)加入IPTG使其终浓度为1mM。目的蛋白的最佳诱导时间可能在2~16h,依蛋白而异。

6)37℃,120rpm培养3~4h。为了确定目的蛋白的最佳诱导时间,建议作一个时间周期优化实验,范围从2~16h。

 

7)将培养物冰浴10min。4℃,5,000 x g离心10min收集菌株。

8)吸掉上清,将沉淀保存在-20℃(也能保存在更低的温度)。

 

IPTG母液(1M)配制

称量2.38g IPTG(Mw: 238.30)溶于适量去离子水,充分溶解后,调整终体积到10ml,并过滤除菌,即得到1M ITPG母液。

氯霉素母液(34mg/ml)配制

称量适量氯霉素溶于乙醇配制成34mg/ml储存液,-20℃保存。工作浓度为34µg/ml。