K599 Electrocompetent Cell 农杆菌电转感受态细胞


描述

K599 Electrocompetent Cell 农杆菌电转感受态细胞

 

产品标签:

K599;C58C1;MSU440;Agrobacterium rhizogenes发根农杆菌;pCAMBIA2301;Streptomycin链霉素;Rifampicin利福平;

 

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货号 产品名称 规格 价格(元)
MF2456-0500UL K599 Electrocompetent Cell农杆菌电转感受态细胞 10×50μl 720
MF2456-2500UL K599 Electrocompetent Cell农杆菌电转感受态细胞 50×50μl 3000

【好消息】:见我司金畔生物整理的根癌(发根)农杆菌感受态细胞技术专题。

 

菌株描述

发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)是根瘤菌科农杆属的一种革兰氏阴性土壤细菌,能够侵染大多数双子叶植物和少数单子叶植物以及个别裸子植物。起关键作用的是其携带的Ri质粒,含有负责发根自主性生长和冠瘿碱合成的基因。结构上于Ti质粒类似,主要有致毒区(Vir),T-DNA区以及冠瘿碱合成功能区等。

 

根据合成冠瘿碱的不同,Ri质粒分为4种类型:1)甘露碱型;2)黄瓜碱型;3)农杆碱型;4)米奇矛型。

发根农杆菌菌株K599(NCPPB2659)含有pRi2659农杆碱型Ri质粒,具有广泛的宿主范围(葫芦科,豆科,茄科等),同时具有链霉素抗性。

 

我司金畔生物提供的K599电转感受态细胞经特殊工艺制作,特别适合大质粒的转化。基因型为Agrobacterium rhizogenes (strR ) pRi2659 (agropine type),经pCAMBIA2301质粒(卡那霉素抗性)检测转化效率>105 cfu/μg DNA。

 

产品包装

组分编号 组分名称 货号(规格)
MF2456-0500UL MF2456-2500UL
MF2456-A K599 Electrocompetent Cell 10×50μl 50×50μl
MF2456-B pCAMBIA2301 Control Vector (10ng/μl) 10μl 10μl

 

保存与运输条件:

保存:-80℃保存,1年有效。 

运输:干冰运输。

 

注意事项

1) 感受态细胞应保存在-80℃,不可反复冻融和放置时间过长,以免降低感受态细胞的转化效率。

2) 整个转化操作,严格根据相应温度及无菌条件要求进行。

 

3) 加入质粒的体积不应大于感受态体积的1/10。质粒不纯或存在乙醇等有机物污染,会导致转化效率急剧下降。质粒增大一倍,转化效率下降一个数量级。

4) 为确保最高转化效率,整个操作过程应尽量轻柔,并保持低温。

 

5) 电转感受态细胞中不可混入气泡,转化高浓度的质粒可相应减少最终涂板用量。

6) 平板上克隆密度过大时,由于营养不足,克隆生长变慢,菌落变小。为获得大菌落,应减少质粒用量。

7) K599具链霉素抗性,不可用于具链霉素抗性质粒的转化。

 

8) 为了保证最佳的转化效率,发根农杆菌的培养务必使用TY培养基(配方见附表1)。

9) 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

 

使用方法

1) 将0.1 cm电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净吸水纸上5min,待其沥干水分,正置5min,使乙醇充分挥发干净,立即插入冰中,压实冰面,电极杯顶离冰面0.5cm以方便盖上杯盖,冰中静置5min使其充分降温。

2) 取-80℃保存的农杆菌感受态细胞插入冰中5min,待其完全融化。

 

3) 往50μl感受态细胞悬液中加入0.01~1μg(体积不大于6μl)质粒DNA,用手拨打管底使其混匀,立即插入冰中。用枪轻轻吹打混匀感受态细胞-质粒之后快速转移到电击杯中,盖上杯盖,空管保留待用【注意:质粒DNA最好用试剂盒抽提,且用双蒸水溶解。由于感受态转化效率较高,第一次使用最好做预试验确定最佳的质粒用量】。

 

4) 启动电转仪,设置参数:C=25 μF,PC=200 ohm,V=2400 V(此参数参考Bio-rad,具体使用请参考电转仪推荐步骤来操作),将电击杯快速放入电转槽中,电击完成快速插入冰中。

5) 加入1ml无抗生素的TY并转移到感受态空管中,于28℃振荡培养2~3h。

 

6) 6,000rpm离心1min,留取100ul左右上清,之后用枪轻轻吹打重悬菌体。之后加到含相应抗生素的TY平板上,用无菌玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。室温正置10 min,待液体被吸收后,倒置平板,28℃培养2-3天。

 

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附表1固体和液体TY培养基配方

组分Component TY(液体)/升 TY(固体)/升
胰蛋白胨Tryptone 5g 5g
酵母提取物Yeast extract 3g 3g
琼脂Agar / 15g
补水到1L,121℃,20min高压灭菌 补水到1L,121℃,20min高压灭菌
氯化钙CaCl2 配制1M CaCl2水溶液,121℃,20min高压灭菌。之后按照10ml/L加入上方灭菌的液体营养液。 配制1M CaCl2水溶液,121℃,20min高压灭菌。之后按照10ml/L加入上方灭菌的液体营养液。

 

附表2常见发根农杆菌对抗生素敏感性总表

农杆菌菌株 羧苄(carb) 链霉素(strep) 利福平(rif) 庆大霉素(gent) 卡那霉素(kan)
Ar A4 S S S S R
Ar Qual S R S R S
Ar 1193 R R R S S
K599 S R S S S
C58C1 S R R S S
MSU440 S R S S S
【备注】:S代表敏感,R代表抗性。

 

附表3常见农杆菌抗生素配制方法

抗生素 配方 母液 工作液
羧苄青霉素 去离子水溶解,0.22μm滤膜除菌 50mg/ml 50μg/ml
硫酸卡那霉素 去离子水溶解,0.22μm滤膜除菌 50mg/ml 50μg/ml
链霉素 去离子水溶解,0.22μm滤膜除菌 10mg/ml 50μg/ml
庆大霉素 去离子水溶解,0.22μm滤膜除菌 20mg/ml 40μg/ml
利福平 DMSO溶解,0.22μm有机相滤膜除菌 10mg/ml 20μg/ml
氯霉素 无水乙醇溶解,0.22μm有机相滤膜除菌 34mg/ml 34μg/ml