PicoGreen dsDNA Assay Kit 双链DNA(dsDNA)定量检测试剂盒

Picogreen dsDNA Reagent;双链DNA检测试剂;RiboGreen;RNA定量试剂;ssDNA定量试剂;药物残留DNA检测;

Picogreen是一种极为灵敏的荧光核酸染料,常用于双链DNA的定量检测。历来DNA浓度的测定在cDNA文库的构建,DNA亚克隆、PCR产物的估测等领域中具有重要意义,疫苗等生物制品中残留微量DNA的检测更是直接关系到人类的健康。

Picogreen dsDNA定量检测:Picogreen仅在与DNA双链结合后才发出荧光,且所产生的荧光与DNA浓度呈正比,在存在ssDNA、RNA和单体核苷酸的条件下,可以选择性地检测低至25pg/ml的dsDNA。该分析在三个数量级范围内呈线性,且几乎无序列依赖性,可以精确地测量多个来源的DNA,包括基因组DNA、病毒DNA、小量提取DNA或PCR扩增产物。

相比传统的方法,Picogreen dsDNA Quantitation Reagent定量具有以下优势:①灵敏度高:数量级较UV吸光读数更敏感,可节省宝贵的样品;②特异性强:在等摩尔的RNA存在的条件下,对dsDNA具有特异性;③耐受性好:耐受较高浓度的盐、尿素、乙醇、氯仿、去垢剂、蛋白或琼脂糖,可以直接定量PCR扩增产物而无需从反应混合物中纯化DNA。④易于使用——只需在样品中加入染料,等待5分钟,然后读数即可,且适用于96和384孔板;与大多数基于荧光的酶标仪和荧光计兼容。⑤适用范围广:可适用于PCR的分析、芯片样品、DNA损伤分析、酶活性分析、基因组DNA定量以及复杂混合物中dsDNA的检测和病毒DNA定量等多种领域。

本试剂盒含有实验所需的所有试剂,使用更快捷方便。若按照2ml反应体系来计算(比色皿),10×100 µL kit可做100次反应;若按照200µl反应体系来计算(96孔板),10×100 µL kit可做1000次反应;单次反应体系取决于荧光检测仪器。

产品组分

编号 组分名称 产品编号规格
MF0781-0.5ML MF0781-1ML
A Picogreen dsDNA reagent (200× in DMSO) 100µl×5 100µl×10
B Lambda DNA standard (10µg/ml) 1ml 1ml×2
C 1×TE Buffer 100ml 100ml×2
A置于2-8℃干燥避光保存,亦可置于≤-20℃长期保存;

B置于2-8℃,亦可置于≤-20℃长期保存;

C置于2-8℃保存,长期不用亦可置于-20℃保存;

保存与运输方法

保存:2-8℃避光保存,1年有效。

运输:冰袋运输。

注意事项

  • Picogreen含DMSO(已知有毒试剂),操作时请注意防护。
  • 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

一、PicoGreen (2×)工作液配制

使用前将PicoGreen dsDNA reagent回温至室温;PicoGreen是以100µL 200×的浓缩液形式保存于无水DMSO

中。实验当天,根据实验需求用1×TE按1:100 的比例稀释适量母液到PicoGreen (2×)。

例如要准备足够的操作溶液以2ml检测体系测定20个样品,可向19.8mL1×TE 中加入200μL PicoGreen dsDNA reagent (200×)。

注意】:a)由于试剂容易吸附到玻璃表面,要在塑料容器中配制。b)PicoGreen见光易降解,所以应将配好的溶液用铝箔包住或放置暗处避光保存。c)溶液最好在配制好数小时内使用,以保证最佳结果。d)Picogreen的最终工作浓度建议为1×;用户也可根据实际情况调整此浓度,比如:最终工作浓度调低到0.5×。

二、 检测步骤

2.1 Lambda DNA standard (200ng/ml)的配制

用1×TE对Lambda DNA standard (10µg/ml)进行50倍稀释。比如,向10µl Lambda DNA standard (10µg/ml)加入490µl 1×TE混匀,此时标准品浓度为200ng/ml;

2.2 标准曲线的制备

【注意】:根据2010年《中国药典》所提,PicoGreen定量DNA的方法检出限~0.3ng/ml。DNA含量在1.25-80ng/ml范围内线性较好(R2>0.99),因此,在此范围内设置浓度梯度,建议标准曲线较好。

比色皿体系检测(2ml

a、按照表1 向一次性微量比色皿中加入TE和Lambda DNA standard(200ng/ml),通过梯度稀释获得相应浓度的标准溶液,随后加入1ml PicoGreen (2×)定量试剂,混匀后,于室温避光孵育2-5min,并以1×TE缓冲液为blank。注意】:确信不要在样品中引入气泡,轻轻地弹微量检测皿的外部,可以驱散气泡。

表1 比色皿体系所需加入各组分量及标准品终浓度表
TE (µl) Lambda DNA standard (µl) PicoGreen (2×) (µl) Lambda DNA standard终浓度
0 1000(200ng/ml) 1000 100ng/ml
200 800(200ng/ml) 1000 80ng/ml
400 600(200ng/ml) 1000 60ng/ml
600 400(200ng/ml) 1000 40ng/ml
800 200(200ng/ml) 1000 20ng/ml
900 100(200ng/ml) 1000 10ng/ml
950 50(200ng/ml) 1000 5ng/ml
1000 0(200ng/ml) 1000 0ng/ml (blank)

b、于荧光仪中检测各浓度荧光值,Ex/Em=~480nm/520nm。

注意】:为了确保荧光读数在荧光仪的检测范围内,应调节增益使含最高DNA浓度的样品荧光值接

近荧光仪的最大值;为了减少光漂白,应保持所有样品的检测时间一致。

c、各浓度标准溶液得到的荧光值减去空白对照荧光值,之后对DNA浓度和荧光值做标准曲线。

d、测量待检样本的荧光值。根据荧光值和所建立的标准曲线,来确定样本DNA的浓度。

  • 微孔板体系检测(200µl)

a、 按照表2 向96孔板中加入TE和Lambda DNA standard(200ng/ml),通过梯度稀释获得相应浓度的标准溶液,随后加入100µl PicoGreen (2×)定量试剂,混匀后,于室温避光孵育2-5min,并以1×TE缓冲液为blank。注意】:确信不要在样品中引入气泡,轻轻地弹微孔板的外部,可以驱散气泡。

表2酶标板体系所需加入各组分量及标准品终浓度表
TE (µl) Lambda DNA standard (µl) PicoGreen (2×) (µl) Lambda DNA standard终浓度
0 100(200ng/ml) 100 100ng/ml
20 80(200ng/ml) 100 80ng/ml
40 60(200ng/ml) 100 60ng/ml
60 40(200ng/ml) 100 40ng/ml
80 20(200ng/ml) 100 20ng/ml
90 10(200ng/ml) 100 10ng/ml
95 5(200ng/ml) 100 5ng/ml
100 0(200ng/ml) 100 0ng/ml (blank)

b、于荧光酶标仪中检测各浓度荧光值,Ex/Em=~480nm/520nm。

注意】:为了确保荧光读数在荧光仪的检测范围内,应调节增益使含最高DNA浓度的样品荧光值接

近荧光仪的最大值;为了减少光漂白,应保持所有样品的检测时间一致。

c、各浓度得到的荧光值减去空白对照荧光值,之后对DNA浓度和荧光值做标准曲线。

d、测量待检样本的荧光值。根据荧光值和所建立的标准曲线,来确定样本DNA的浓度。

附表 PicoGreen定量耐受的污染物列表

物质名称 最大耐受浓度 信号变化百分比
Salts
Ammonium acetate 50 mM 3% decrease
Sodium acetate 30 mM 3% increase
Sodium chloride 200 mM 30% decrease
Zinc chloride 5 mM 8% decrease
Magnesium chloride 50 mM 33% decrease
Urea 2 M 9% increase
Organic Solvents
Phenol 0.1% 13% increase
Ethanol 10% 12% increase
Chloroform 2% 14% increase
Detergents
Sodium dodecyl sulfate 0.01% 1% decrease
Triton X-100 0.1% 7% increase
Proteins
Bovine serum albumin 2% 16% decrease
IgG 0.1% 19% increase
Other Compounds
Polyethylene glycol 2% 8% increase
Agarose 0.1% 4% increase