Zeocin博莱霉素(博来霉素)CAS NO.:11006-33-0

Zeocin博莱霉素(博来霉素);Phleomycin腐草霉素;Sh ble基因;Hygromycin B潮霉素B;G418遗传霉素;CAS NO.:11006-33-0

产品描述

Zeocin是一种作用于真核和原核细胞的选择性抗生素。来自Streptoalloteichus hindustanus的Sh ble基因赋予Zeocin抗性,该基因编码一种13,665Da大小的蛋白,以化学计量方式结合Zeocin,抑制其DNA双链切割活性。因此,能表达此蛋白的真核和原核宿主细胞具有Zeocin抗性。

Zeocin是腐草霉素D1(Phleomycin D1)的商业名称,是一种铜离子螯合的糖肽抗生素(来源于链霉菌Streptomyces verticillus的突变株),铜离子的存在使其呈蓝色,此铜螯合的形式为无活性。当抗生素进入细胞后,二价铜离子(Cu2+)被还原为一价铜离子(Cu+),并被细胞内的巯基化合物去除。铜离子被去除后,Zeocin被活化,嵌入DNA使其断裂,最终导致细胞死亡。Zeocin作用谱广泛,对细菌、真核微生物、植物和哺乳动物细胞具很强的毒性。

本品以蓝色粉末形式提供,低内毒素水平,达细胞培养级。通常情况,哺乳动物细胞的筛选浓度范围是50-400 µg/ml,细菌的筛选浓度为25 µg/ml。

我司还提供无菌溶液形式的Zeocin(货号:MS0009-125MG,MS0009-1000MG),浓度是100mg/ml,使用起来更加方便,只需直接加入培养基到所需工作浓度即可。

产品特性

1) CAS NO.:11006-33-0

2) 外观:蓝色粉末

3) 内毒素:<1 EU/mg

4) 溶解性:易溶于水(>500 mg/ml)

5) 质量控制:分别对Zeocin敏感或Zeocin耐性的哺乳动物细胞测定抗生素活性。

保存与运输方法

保存: +4℃干燥保存,至少1年有效。

运输:室温运输。

注意事项

1) Zeocin粉末容易受潮,一定要注意干燥保存。每一次使用完后需盖紧管子。

2) Zeocin是一种不稳定化合物,在高pH和低pH或存在弱氧化剂的情况下会发生不可逆变性。

3) Zeocin对高浓度酸和碱都很敏感,但短期暴露在弱酸下能耐受。

4) Zeocin对光敏感,需将抗生素,或含该抗生素的平板或培养基置于黑暗处。

5) Zeocin有毒,操作时需注意防护,切勿与身体或皮肤直接接触。

6) Zeocin™是Invivogen公司的商标产品。

7) 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

母液制备

1)将低温保存的Zeocin置于室温回温至少20min,加入适量HEPES buffer(5g/L, pH 7.2±0.1),充分溶解,配制成100mg/ml溶液。2)用0.22µm滤膜过滤除菌。3)溶液置于4℃保存12个月有效,或-20℃保存,18个月有效。

操作步骤(以哺乳动物细胞为例)

【注1】:Zeocin的杀灭机制不同于新生霉素(neomycin)和潮霉素B(hygromycin B),细胞不会聚集成团和从培养板表面脱落。一旦接触到Zeocin,敏感细胞会出现如下的形态变化:1)细胞体积明显增加(类似于巨细胞病毒感染容纳性细胞引起的肿大效应);2)异常的细胞形状包括细胞长臂(long appendages)出现;3)胞浆内出现大型空泡(源于内质网、高尔基体或支撑蛋白的破裂);4)质膜和核膜破裂,导致膜上出现许多孔。这些敏感细胞最终会完全破损,仅仅以细胞碎片的形式存在。

【注2】:Zeocin抗性细胞按正常周期分化产生不同于敏感细胞的克隆。抗性细胞在形态上,与未接触Zeocin™的正常细胞没有任何差异。

【注3】:Zeocin用于哺乳动物细胞筛选常用浓度为50-1000µg/ml(平均常用浓度为250-400μg/mL),影响筛选浓度的主要因素包括离子强度,细胞类型,细胞密度以及生长速率。以下步骤仅作参考,请根据自身实验体系做适当调整。

一、细胞对Zeocin敏感性的确定(杀灭曲线建立)

1) 重新铺板或者将满盘细胞重新分盘,使得细胞密度约25%,按照8个平板/组准备,培养24h,去除旧培养基。

2) 加入含不同浓度Zeocin的筛选培养基,Zeocin浓度可设置为0, 50, 100, 200, 400, 600, 800和1000 μg/ml,每个浓度做3个平行;也可根据自身实验体系,设置不同的浓度梯度。

3) 每3-4天更换新鲜的筛选培养基,并观察存活细胞的比例。选择在合适时间(1-2周内)杀死大多数细胞的浓度为最佳工作浓度。【注】:若是难以在显微观察下区分活细胞,建议使用台盼蓝染色来计算存活细胞的数量,以确定Zeocin的最适浓度。

二、筛选稳定转染细胞系

1) 转染细胞,用100mm培养皿进行培养。以未转染的细胞作为阴性对照。

2) 转染后,用预热的1X PBS洗涤一次,加入新鲜培养基。

3) 转染48-72h后,用含有最佳浓度Zeocin(由灭杀曲线确定)的新鲜培养基筛选细胞。为了更好的鉴定和筛选细胞集落,建议将细胞按比例稀释成一系列浓度。

【注】:若待筛选细胞对Zeocin的抗性明显强于大部分细胞,按照以下方法克服此类耐性:用含Zeocin培养基进行细胞分盘,置于37°C孵育2-3h,使得细胞贴壁。然后将细胞置于4°C,2h。记得使用Hepes作为培养基的缓冲体系。重新将细胞置于37°C孵育。4°C孵育细胞的目的是短时间内终止细胞分化,使得Zeocin能发挥作用,杀死细胞。

4) 每3-4天更换新鲜的选择培养基,直到出现细胞集落。

5) 挑选并转移克隆到96或48孔板中。在进行更大孔径培养板或培养皿上扩大培养之前,确保培养细胞密度近100%。

三、稳定转染细胞系的维持培养

可采取以下方式维持培养稳定转染细胞:

1)使用含相同剂量Zeocin的筛选培养基来维持培养;

2)降低Zeocin剂量为原来的一半进行维持培养;

3)使用正好能预防敏感细胞生长但不足以致死的Zeocin剂量来维持培养【根据杀灭曲线来判断】。

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名称 简单描述
Blasticidin S杀稻瘟菌素S(灭瘟素) bsr/BSD基因筛选抗生素
Phleomycin腐草霉素 Sh ble基因筛选抗生素
Zeocin博莱霉素 Sh ble基因筛选抗生素
G418 Sulfate (Geneticin)遗传霉素 neo基因筛选抗生素
Puromycin Dihydrochloride嘌呤霉素盐酸盐 pac基因筛选抗生素
Hygromycin B潮霉素B hph基因筛选抗生素

附表一某些哺乳动物细胞的Zeocin工作浓度

Zeocin常用的工作浓度为100μg/ml,但是,最佳的工作浓度需要根据细胞类型和实际的实验体系来确定。某些哺乳动物细胞的建议工作浓度列在下表:

细胞系 培养基 Zeocin工作浓度(μg/ml)
B16 RPMI 20-250
CHO DMEM 100-500
COS DMEM 100-400
HEK293 DMEM 100-400
HeLa DMEM 50-100
J558L RPMI 400
MCF-7 DMEM 100-400
MEFs DMEM 200-400
THP-1 RPMI 200