Caspase-3 Activity Assay Kit (Colorimetric)   Caspase-3活性检测试剂盒(比色法)


描述

Caspase-3 Activity Assay Kit (Colorimetric)  

Caspase-3活性检测试剂盒(比色法)

 

产品信息

产品名称

产品编号 规格 价格(元)

Caspase-3活性检测试剂盒(比色法)

MX3225-20T 20T

880

Caspase-3活性检测试剂盒(比色法) MX3225-100T 100T

2890

产品描述

Caspases(Cysteine-requiringAspartate Proteases)是一个高度保守的半胱氨酸蛋白酶家族,特异性识别底物中的天冬氨酸残基,在介导细胞凋亡的过程中发挥着非常重要的作用。Caspases以潜在酶原的形式表达,通过自发蛋白分解机制或经其他蛋白酶(通常是其他caspases)加工处理的方式被活化。人caspases可细分为三大功能组:细胞因子活化(caspase-1,-4,-5和-13),凋亡启动(caspase-2,-8,-9和-10)和凋亡执行(caspase-3,-6和-7)。

Caspase-2(Caspase 2),也称为Nedd2、ICH-1,含核定位所依赖的长前肽结构域的一类caspase。一旦凋亡通路被激活,caspase酶原在Asp316位上被切割生成一个14kDa片段和一个32kDa的前肽结构域/大亚基。接下来在Asp152和Asp330被切割,进一步生成18kDa大亚基和12kDa小片段。Caspase-2是应对基因毒性应激或有丝分裂障碍的核凋亡反应物。一旦招募生成含p53诱导死亡结构域蛋白-PIDD的复合物,caspase 2被激活。因此,Caspase-2被认为是核启动caspase,并且在下游的凋亡途径中需要激活caspase-9和caspase-3。

Caspase-3活性检测试剂盒(比色法)(Caspase-3 Activity Assay Kit, Colorimetric or Caspase-3 Colorimetric Assay Kit)以偶联上发色基团pNA的caspase-3序列特异性的多肽为底物。当底物被caspase-3剪切后,发色基团被释放出来,进而用酶标仪或分光光度计来测定其吸光值(λ=405nm或400nm)。通过计算OD凋亡诱导组/OD阴性对照组的比值来确定凋亡诱导组caspase-3的活化程度。

本品适用于培养细胞以及新鲜组织的caspase-3活性检测。

产品包装

编号 组分名称 保存方法 货号(规格)
MX3225-20T MX3225-100T
MX3225-A Lysis Buffer裂解缓冲液 2-8℃ 5ml 20ml
MX3225-B 2× Reaction Buffer 2×反应缓冲液 2-8℃ 1ml 5ml
MX3225-C Caspase-3 Substrate Caspase-3底物 -20℃避光 100μl 500μl
MX3225-D 0.1M DTT -20℃避光 60μl 250μl

保存与运输方法

保存:-20℃保存,1年有效。开盒后置Lysis Buffer和2× Reaction Buffer于2-8℃保存。Caspase-3 Substrate和0.1M DTT需要避光冻存。

运输:冰袋运输。

注意事项

1) Caspase-3 Substrate需避光保存和使用。

2) 某些凋亡诱导剂诱导的凋亡可能通过caspase-3非依赖的方式进行,此种情况使用本品检测的caspase-3活性无明显变化,则,需要考虑凋亡机制中的其他信号通路。

3) 起始细胞数量需达3~5×106个或新鲜组织量达50~100mg,以保证达到测定所需的100~200μg蛋白量。Caspase-3的活性与细胞裂解后的蛋白含量有关,如测定的OD值偏低,可通过增加细胞数量或组织量的方法来提高蛋白量。

4) 优先选择测定λ=405nm的吸光值;如有困难,再测定λ=400nm的吸光值。

5) 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

1.需要的其他试剂和材料

仪器:低温高速离心机、酶标仪或分光光度计(100μl的比色皿)(λ=405nm或400nm)、微量移液器、玻璃匀浆器(组织样本)

耗材:1.5ml微量离心管、96孔酶标板(透明)或100μl的比色皿

试剂:PBS、蛋白定量试剂(比如:Bradford法蛋白浓度测定试剂盒)

2.试剂准备

2.1 Lysis Buffer(含DTT)

于实验前,按每50μl Lysis Buffer 加入0.5μl DTT的比例准备足量的裂解工作液,置于4℃或冰上待用。

2.2 2×Reaction Buffer(含DTT)

于使用前,按每50μl 2×Reaction Buffer 加入0.5μl DTT的比例准备足量的反应工作液。

3.样本准备

3.1 细胞裂解

a)用合适方法诱导细胞凋亡,同时设立阴性对照组(不加诱导剂),收集3~5×106个细胞。

b)PBS洗涤细胞2次(2000rpm,离心5min),尽量吸尽PBS上清。

c)往离心的沉淀细胞中加入15~200μl预冷的Lysis Buffer(含DTT),吹打混匀。

d)置冰上裂解20~60min,其间涡旋振荡3~4次,每次10s;或冻融2~3次。

e)4℃,10,000rpm离心1min。

f)小心吸取上清(含裂解释放的蛋白质)转移到新的EP管内,置于冰上待用。

g)取少量上清(1~2μl),用常规方法(Bradford法)测定蛋白浓度。

3.2 组织裂解

a)取50~100mg组织置于培养皿内,用手术剪剪碎成3mm×3mm左右的小块,加入150~200μl预冷的Lysis Buffer(含DTT),用玻璃匀浆器上下手动匀浆15次,注意低温操作。

b)将组织匀浆液转移到1.5ml预冷的离心管,10,000rpm,4℃离心5min。

c)小心吸取上清(含裂解释放的蛋白质)转移到新的EP管内,置于冰上待用。

d)取少量上清(1~2μl),用常规方法(Bradford法)测定蛋白浓度。

4.Caspase-3活性检测

 

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