Wako Phos-tag-用于磷酸化蛋白分析使用问题与解答

Wako Phos-tag-用于磷酸化蛋白分析使用问题与解答

1.     Phos-tag® Acrylamide的溶解

5mmmol/ Phos-tag® 液体 (3v/v% 甲醇):

1)    10mg  Phos-tag® Acrylamide 里加入 0.1mL 甲醇

2)    使用枪头搅拌混合直至完全溶解。

3)     加3.2mL 蒸馏水, 用枪头混匀。

2-8℃避光保存。不适合零度以下保存。建议保存时间6个月。

注意:避免溶解过程出现白色悬浮颗粒。

2.     α-Casein, from Bovine Milk, Dephosphorylated(038-23221),阳性对照(含有磷酸化和非磷酸化

α-Casein),如何使用?

用水或者上样buffer溶解。用水溶解后,冷冻保存。电泳条件:Phos-tag® 50umol/L,分离胶浓度 10%。

电流:30mM,1小时。

3.     用Alkaline Phosphatase(for Biochemistry)(018-10693)进行磷酸化蛋白的去磷酸化反应体系。

37℃,过夜。# 10 mg/mL phosphorylated protein 50 μL
# 0.50 M Tris/HCl buffer (pH 9.0) containing 0.10 M MgCl2 10 μL
# Sterilized water 39 μL
# Alkaline phosphatase(018-10693). 0.3 unit / 1 μL有一点需要注意:ALP活性化使用Mg离子,相

同的非磷酸化蛋白质用ALP处理的样品的条带和没有用ALP处理的样品的条带的位置不同。

4.     Phos-tag® SDS-PAGE实验没有成功分离磷酸化蛋白:

1) 使用α-Casein, from Bovine Milk, Dephosphorylated(038-23221)作为阳性对照,确认实验条

件和试剂均没有问题。

2) 可使用Phos-tag®Biotin检测样品中是否有磷酸化蛋白。确认有磷酸化蛋白后,再通过

Phos-tag ®SDS-PAGE进行分离鉴定。

3) 经质谱鉴定有表达磷酸化蛋白,建议增大样品的含量,可使用Phos-tag ®Agarose进行磷酸化蛋白

的富集。磷酸化蛋白含量过低,会影响其分离效果。

4) 文献报道有表达磷酸化蛋白,或者同源蛋白有表达磷酸化蛋白的,建议用Phos-tag® Biotin先确认

样品中是否有磷酸化蛋白。

5) 建议样品的pH值在7左右。酸性或者碱性条件下,Mn2+-Phos-tag®与磷酸化基团的特异性结合较

差。

6) 避免样品中含有高浓度的还原剂,变性剂,表面活性剂等。β-巯基乙醇浓度不高于0.2M(或者5%)。

7) 进行Phos-tag® SDS-PAGE的最佳样品是纯化的蛋白。如果是细胞裂解液,体外激酶反应液,组织均

浆液等,需要摸索最佳的分离胶,Phos-tag® Acylamide的浓度。建议Phos-tag® Acrylamide浓度

从50uM开始摸索。

5.     Phos-tag®SDS-PAGE凝胶用于Western Blotting实验的优化建议:

1) 可以检测的样品包括体外激酶反应体系,细胞裂解液,组织均浆液。

2) 每孔样品的上样量是10~30ug(请根据蛋白表达量进行调整)

3) 制备样品中含有的还原剂、变性剂、螯合剂、钒酸等会使电泳条带发生弯曲或者拖尾。通过TCA沉淀或

渗析法降低杂质含量。

4) 建议样品的pH值在7左右。如果加入上样缓冲液后溶液显黄色或者橙色,加入Tris缓冲液调整pH值为7。

5) 目的蛋白分子量大于60kDa,分离胶的丙烯酰胺浓度为6%;目的蛋白分子量小于60kDa,分离胶的丙烯

酰胺浓度为8%。

6) 如果样品中含有大量蛋白,比如细胞裂解液,组织均浆液,Phos-tag® Acylamide浓度为5~25uM。

若目的蛋白浓度低,建议Phos-tag® Acylamide浓度为100uM。

7) Phos-tag ®SDS-PAGE凝胶用于Western Blotting实验,湿法转膜建议:10mM EDTA的转移缓冲液

处理凝胶10min,不含有EDTA的转移缓冲液处理凝胶10min。重复3次。强烈建议湿法转膜

8) Phos-tag® SDS PAGE半干法转膜建议:

i.      电泳后用含有EDTA的转移缓冲液处理凝胶,EDTA的浓度为 100mM。100mM EDTA的转移

缓冲液处理凝胶10min,不含有EDTA的转移缓冲液处理凝胶10min。重复3次。

ii.      转膜的电流值提高2%~3%, 延长时间2成。

iii.      转膜的缓冲液加SDS,加到大约0.05~0.2%,转膜效率会提高。

9) 使用目的蛋白的非磷酸化抗体即可。比如检测各种肿瘤细胞系中Src激酶活性实验,用Src的非磷酸化抗

体即可。

10) 和光的WIDE-VIEWTM Prestained Protein Siza MarkerIII(230-02461)可检测作为转膜效率,但是无

法判断分子量。

11) 一般预染的蛋白marker在Phos-tag®SDS-PAGE中条带会弯曲,无法判断蛋白分子量。

12) 不能确认磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白的分离,请进行常规的SDS-PAGE,Western Blotting实验。比

对目的蛋白的迁移率。

13) 不能确认是因为蛋白发生磷酸化还是出现降解造成蛋白条带迁移,请进行常规的SDS-PAGE实验,确

认不会出现条带迁移。

14) 目的蛋白磷酸化与非磷酸化分离效果不佳,使用α-Casein, from Bovine Milk, Dephosphorylated

(038-23221)作为阳性对照,确认实验条件和试剂均没有问题。如果确认能够分离,调整分离胶,

Phos-tag® Acylamide的浓度。建议使用品质佳的MnCl2(139-00722)。

产品编号 产品名称 产品规格 产品等级
304-93526  Phos-tag Acrylamide AAL-107
5mM Aqueous Solution Phos-tag 丙烯酰胺5mM水溶液 0.3mL 蛋白研究
300-93523  Phos-tag Acrylamide AAL-107
Phos-tag 丙烯酰胺 2mg 蛋白研究
304-93521  Phos-tag Acrylamide AAL-107
Phos-tag 丙烯酰胺 10mg 蛋白研究
134-15302 Manganese(II) Chloride Tetrahydrate氯化锰四水合物 25g for Molecular Biology

发表评论