非酒精性脂肪肝NAFLD动物模型的多种饮食诱导方案

非酒精性脂肪肝NAFLD动物模型的多种饮食诱导方案

非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)和酒精性肝病(ALD)是慢性肝病中最主要的两种。NAFLD包括一系列病变,从肝脂肪变性到炎症,在没有大量饮酒的情况下,伴有或不伴有纤维化。

  适用于研究NAFLD的动物模型有新西兰兔、大鼠、小鼠,其中大鼠和小鼠比较常见。本文介绍几种由不同饮食诱导的大小鼠NAFLD模型。

饮食诱导模型

相似于人类NAFLD的代谢紊乱,以营养过剩为基础的动物模型可以模拟肝脏的组织学特征。饮食诱导的NAFLD动物模型主要基于高脂、高糖等饮食结构,这些动物模型通常包括一种或多种饮食模式组合,可诱发单纯性脂肪变性和脂肪性肝炎。

1.高脂饮食:高脂饮食的脂肪供能占比通常在45-70kcal%,造模周期为8-10周,实验动物包括C57BL/6小鼠、BALB/c小鼠、SD大鼠、Lewis大鼠、Wistar大鼠,其中大鼠更容易被高脂饮食诱导。

高脂饲料诱导大鼠构建NAFLD模型

非酒精性脂肪肝(NAFLD)包含了一系列的疾病发展阶段,从一般脂肪变性进展到脂肪变性与炎症并发的非酒精性脂肪肝炎(NASH),随后进展为肝纤维化、肝硬化和肝癌。大多数肥胖的成年人有脂肪肝型态,他们的患病率达到30%以上,因此,NAFLD的患病率会随着肥胖率的升高而升高。

为研究NAFLD的发病机制并找出治疗方法,建立动物模型是至关重要的一步。科研人员大多利用高脂饲料诱导大鼠建立NAFLD模型,但近几年建立的NAFLD动物模型所采用的高脂饲料配方、建模周期均不一致,在研究方面具有不同的参考价值。本文对多种高脂饲料诱导大鼠建立NAFLD模型的方法进行总结,如有疑问,欢迎与我们的技术团队讨论。

饲养环境

环境是饲养实验动物的必要条件之一,对于实验动物的成活率有着很大的影响,在相关论文中对温度和湿度几乎都有详细叙述,并强调了它的重要性。考虑到NAFLD模型对环境并无特殊要求,所以科研人员一般采取了22±2℃,湿度50%-60%,12小时循环照明的普通饲养环境。

不过值得注意的是,大鼠对于环境的变化很敏感,因此要保证饲养环境各项指标的稳定。同时由于高脂饲料的缘故,大鼠的排泄物异味更重,需要及时更换垫料,饲料和饮水也需要灭菌处理,以免对实验造成不必要的影响。

实验大鼠的选择

作为实验的受体,大鼠的选择十分重要,这不仅关系到实验成本,也决定了建模的质量及周期。

清洁级别

对于大鼠的清洁级别选择,综合多篇参考文献,即便使用普通动物,对实验结果也没有明显影响,但考虑到降低大鼠死亡率和实验成本,清洁级别越高的大鼠无疑是越好的。

种类选择

对于实验大鼠的选择主要有Wistar大鼠和SD大鼠。其中SD大鼠相对发育更快,适应能力更强,更利于建模;缺点是价格较高,性格更凶猛。综合考虑,我们认为SD大鼠仍然是更好的选择,但如果预算较少也可以选择前者。

性别选择

在查阅参考的十多篇文献中,科研人员无一例外的选择了雄性大鼠。由于成年的雌性动物代谢存在着明显的周期性,这可能会对实验造成影响,所以在大部分实验中,科研人员更倾向于选择雄性大鼠进行实验。

体重选择

成年大鼠的体重可达300g,考虑到实验时间一般为8-12周,我们认为选取5-6周,即120g-200g的大鼠比较合适。值得注意的是,大鼠之间的体重差异必须小于10%,以免引入无关的变量,对实验结果造成干扰。

高脂饲料配方

高脂饲料的配方无疑是NAFLD建模最关键的因素之一,合适的高脂饲料可以实现低死亡率低,快速建立模型的目标。以下我们将对于高脂饲料的配方进行详细探讨。

猪油含量

猪油含量是高脂饲料的核心,更高的猪油含量可以快速建立NAFLD模型,但会影响大鼠食欲及死亡率;猪油含量过低则会造成建模周期长,症状不明显。在《高脂血症非酒精性脂肪肝大鼠模型的建立》中,科研人员虽然采用了42%猪油含量的高脂饲料在第8周建模成功,但个人认为并不可取,因为如此高的猪油含量会大幅度提高大鼠死亡率。我们建议使用10%猪油含量的高脂饲料,可以在12-16周得到症状较明显的NAFLD模型,而且在环境适宜的情况下,通常不会有大鼠死亡。如果要缩短建模周期,可以适当提高猪油含量,但需要加入其它物质来促进吸收。

其它物质

由于高脂饲料在适口性方面不如常规饲料,会导致大鼠采食量下降,在一些实验中甚至出现了实验组大鼠体重低于对照组的情况。所以很多研究人员在高脂饲料中添加了胆盐(1%),以提高大鼠食欲,促进消化吸收。同时也可以在饲料中添加胆固醇(1%-5%),以促进脂肪肝的形成,缩短建模周期。

建模周期

建模周期和许多因素相关,不能一概而论。例如高脂饲料中的猪油含量对建模周期的影响就非常大。以下我们将讨论使用10%猪油含量饲料前提下所需的建模周期。

在《高脂饮食诱导肥胖与肥胖抵抗型非酒精性脂肪肝大鼠模型的建立》中,研究人员在8周停止建模,解剖大鼠,表明建模成功,但症状较轻,大部分大鼠处于轻度和中度肝炎。而上文提到的研究中,建模时间长达16周,但症状明显,大部分大鼠处于中度和重度肝炎。综上所述,可以证明12-16周是比较合适的建模周期,具体时间可结合需要选择。

木棒磨牙

在《非酒精性脂肪肝动物模型的建立与思考》中,科研人员考虑到高脂饲料质地偏软,所以为实验组大鼠提供了木棒磨牙,结果确实提高了大鼠存活率,体重也是实验组高于对照组的理想状况。

剔除肥胖基因抵抗大鼠

《高脂饮食诱导肥胖与肥胖抵抗型非酒精性脂肪肝大鼠模型的建立》一文中探讨了肥胖抵抗基因大鼠对于建立NAFLD模型的影响。实验结果表明,在同样的饲养条件下,肥胖抵抗基因大鼠的症状确实轻于普通大鼠,这不利于NAFLD模型的建立,所以在实验前应当将其剔除。

总结

高脂饲料诱导大鼠建立NAFLD模型,应选择120-200g的雄性SD大鼠,剔除肥胖抵抗基因大鼠;环境温度应控制在22℃左右,湿度50%-60%;喂养10%猪油含量的高脂饲料,可添加胆盐和胆固醇,在12-16周基本可以建模成功。

2.高胆固醇饮食:含1.25%胆固醇和0.5%胆酸盐的饮食可诱导脂肪变性、炎症和纤维化形成;

3.蛋氨酸胆碱缺乏(MCD)饮食:MCD饮食中蔗糖含量高,脂肪含量适中,但缺乏蛋氨酸和胆碱,它们是肝脏氧化和产生低密度脂蛋白(VLDL)的必要营养素;

蛋氨酸、胆碱联合缺乏饲料(MCD)(MCD: methionine- and choline deficient diet)也称做MCDD,是在脂肪代谢、高脂血症的研究非酒精性脂肪肝病模型,甲基化模型肿瘤模型等疾病模型的造模中经常用到的一款饲料。

蛋氨酸胆碱缺乏模型饲料(AIN-76)

经典MCD饲料
通常我们所见到的没有做特殊说明的MCD饲料都是经典MCD饲料。
这款饲料基于Ain-76标准,10%脂肪含量,蛋氨酸。胆碱不添加,含量基本为0。
一般多用于非酒精性脂肪肝炎(NASH))及后期的肝纤维化、肝硬化方面的造模。
经典MCD饲料在饲喂大、小鼠时,反应相当剧烈,实验鼠体重会持续下降,且不发生胰岛素抵抗。死亡率大大增加。
这与其它方法诱导的非酒精性脂肪肝(NAFLD)大、小鼠模型有显著的不一样,同时也与人类典型的非酒精性脂肪肝炎(NASH))患者情况相反,人类的非酒精性脂肪肝炎(NASH)患者不但会产生肥胖而且对胰岛素抵抗。
非酒精性脂肪肝(NAFLD)(不推荐)
造模周期:2-4周
饲喂方式:自由采食
储存方式:4摄氏度冷藏或-20摄氏度冷冻,避光
对照组:MCs (MCD同源配方,增加蛋氨酸和胆碱)
小贴士:部分MCD饲料在储存时没有做冷藏避光处理,会随着时间越来越黑(避光冷藏会减缓》,这是一种称为美拉德反应的效果,实际不影响造模效果。
非酒精性脂肪肝炎(NASH)
造模周期:5-8周
饲喂方式:自由采食
储存方式:4摄氏度冷藏或-20摄氏度冷冻,避光
对照组:McS (MCD同源配方,增加蛋氨酸和胆碱)
小贴士:部分MCD饲料在储存时没有做冷藏避光处理,会随着时间越来越黑(避光冷藏会减缓),这是一种称为美拉德反应的效果,实际不影响造模效果。

蛋氨酸胆碱缺乏(MCD)饲料普遍应用于脂肪代谢、高脂血症的研究,是构建非酒精性脂肪肝模型、甲基化模型、肿瘤模型的常用饲料。

适用动物:实验大/小鼠(C57、ICR、BALB/C、SD等常见品系)

适用周龄:3-4周离乳即可(若有特殊实验目的,可根据实际情况选取不同周龄的大/小鼠)

产品形状:棒状颗粒(如有特殊需求可以提供粉料等)

储存方式:4℃冷藏(建议)或常温

建议采购量:小鼠按照5克/只/天计算、大鼠按照25克/只/天计算

4.胆碱缺乏性氨基酸(CDAA)饮食:与MCD饮食相似,因为它们都缺乏胆碱。不同之处在于,L-氨基酸的混合物取代了等价相应的蛋白质。

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