PKH67细胞连接试剂盒(用于常规细胞膜标记)


描述

PKH67细胞连接试剂盒(用于常规细胞膜标记)

产品关键词:

PKH67;PKH26;Calcein AM钙黄绿素;PKH67;CFDA SE;In vivo cell tracking体内细胞示踪;Sigma MINI26;Phanos Technologies;

产品信息

产品名称

产品编号               规格   价格(元)      

PKH67 Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling     

PKH67细胞连接试剂盒(用于常规细胞膜标记)

MX4023-100UL

100μl 996
MX4023-200UL 200μl

1946

MX4023-500UL 500μl

3886

【好消息】:应客户的要求,我司对试剂盒内的Diluent C可单独供应,产品信息如下:

产品名称

产品编号                 规格                    价格(元)          

Diluent C for General Membrane Labeling

稀释液C(用于常规细胞膜标记)

MX4022-10ML

10ml

296

MX4022-30ML 30ml

586

产品描述

PKH67细胞连接试剂盒(用于常规细胞膜标记)(PKH67 Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling)是一款基于荧光探针PKH67,用于常规细胞膜标记的检测试剂盒,适用于体外细胞标记,体外细胞增殖以及长期的体内细胞跟踪研究等。

PKH67是一种专利的膜标记探针,与PKH1和PKH2相比,结构上带有更长的脂肪族碳尾,能稳定插入细胞膜脂质区域。正因具更长碳尾,内部数据连续性证明:PKH67具有比PKH2更低的细胞-细胞间转运发生。PKH67呈绿色荧光(见图1),最大激发波长为490nm,最大发射波长是502nm,与标准荧光素(Fluorescein)滤片兼容。PKH67非常适合用于细胞毒性实验,与碘化丙啶(PI,MX4205)或7-氨基放线菌素D(7-AAD,MX4215)这些细胞活力探针联合使用,或者与橙-红色荧光探针比如藻红蛋白(PE,MX4698)、红色荧光蛋白(RFP)等结合使用。根据染料稀释原理,PKH67常用于细胞增殖监测分析,包括抗原特异性的前体频率和带干细胞特性的静息/缓慢分化肿瘤细胞的鉴定。也能用于监测外泌体或脂质体吞噬,细胞-细胞膜转运、吞噬、抗原递呈,以及体内细胞运输研究。

以不分裂细胞为研究对象,通过对体外细胞膜滞留周期和体内荧光强度减弱频率的关联性分析,预测PKH67的体内荧光半衰期为10-12天。这与PKH1和PKH2的体内半衰期相近,这两个探针都成功用于监测周期长达1-2个月的体内淋巴细胞和巨噬细胞运输研究,因此,PKH67适用于需要绿色荧光细胞连接染料的短-中期体内示踪研究,以及体外细胞毒性、吞噬、增殖、抗原递呈,或其它共培养实验。

稀释液C(Diluent C)是本试剂盒配套提供的一种水溶性溶液,特别设计的一种标记媒介能维持细胞活力,同时最大化染料溶解性和标记过程中的染色效率。Diluent C对哺乳动物细胞来说是等渗的,不含去污剂或有机溶剂,也不含生理盐和缓冲剂。根据细胞类型,染料标记后膜的内在化程度,标记细胞可能呈现不同的状态,从明亮,到均匀点状或斑驳状。然而,PKH67荧光在生理范围内不依赖于pH,且每个细胞的荧光强度通常不受染料位置的影响。

图1. PKH67的激发和发射光谱图

我司(金畔生物)提供三种规格的PKH67细胞连接试剂盒(用于常规细胞膜标记),其中:

Mini Kit(CAT#:MX4023-100UL)建议用于小量或初步研究。当使用2ml染色体积(含2μM终浓度的PKH67),本试剂盒含有足量的染料用于检测25次细胞样本(2×107个细胞/次),和足量的Diluent C用于5次细胞样本(2×107个细胞/次)。用户需根据细胞类型和实验目的来优化确定最佳的染料浓度。

Midi Kit(CAT#:MX4023-200UL)适用于中量研究,比如体外细胞增殖或毒性研究。当使用2ml染色体积(含2μM终浓度的PKH67),本试剂盒含有足量的染料用于检测50次细胞样本(2×107个细胞/次),和足量的Diluent C用于30次细胞样本(2×107个细胞/次)。用户需根据细胞类型和实验目的来优化确定最佳的染料浓度。

Maxi Kit(CAT#:MX4021-500UL)适用于大量或体内研究。当使用2ml染色体积(含2μM终浓度的PKH67),本试剂盒含有足量的染料用于检测125次细胞样本(2×107个细胞/次),和足量的Diluent C用于30次细胞样本(2×107个细胞/次)。用户需根据细胞类型和实验目的来优化确定最佳的染料浓度。

产品包装

组分

名称

货号(规格)

MX4023-100UL     

MX4023-200UL     MX4023-500UL     
MX4023-A      PKH67 Dye (1×10-3M in EtOH)     1×100μl 2×100μl

1×500μl

MX4023-B Diluent C 1×10ml 2×30ml

2×30ml

保存与运输方法

保存:2-8ºC避光保存,1年有效。其中组分A(PKH67 Dye)需严格避光,盖子保持拧紧。

运输:冰袋运输。

注意事项

  1. PKH67是以溶于乙醇的储存液形式提供,保存的过程中需避光并拧紧盖子,以防止溶液挥发引起的染料浓度提高。使用前需检查是否有结晶,若有结晶,需在37℃水浴溶晶,超声或涡旋直至完全溶解。
  2. Diluent C使用前需置于室温回温之后再配制标记用的细胞和染料工作液。Diluent C是无菌溶液,不含任何防腐剂或抗生素,使用和保存过程中都注意无菌。
  3. PKH67不能保存在Diluent C内,保存在Diluent C的染色工作液需在使用前配制,现配现用。
  4. 荧光染料均存在淬灭问题,操作和储存过程中需注意避光,以减缓荧光淬灭。
  5. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

操作步骤

1. 自行准备仪器和试剂(试剂盒不提供,用于常规细胞膜标记)

﹒良好分散,均匀的单细胞悬液(悬浮于组织培养基)

﹒含血清的组织培养基(完全培养基)

﹒不含Ca2+、Mg2+和血清的培养基,或生理盐溶液(比如,DPBS或HBSS)

﹒血清,白蛋白或其他系统兼容的蛋白

﹒聚丙烯锥底离心管(4-15ml)

﹒能控温的离心机(高达1000×g)

﹒荧光分析用仪器(荧光酶标板,荧光或共聚焦显微镜,流式细胞仪)

﹒无菌层流净化罩

﹒血球计数板或自动细胞计数装置

﹒载玻片和盖玻片

2. 常规细胞膜标记

【染色流程】:

以下操作流程使用2ml最终染色体积,含2μM PKH67,以及1×107个细胞/ml。

以下所有步骤都在室温下进行(20-25℃)。

1. 取一锥底聚丙烯离心管制备2×107个细胞的单细胞悬浮液,用无血清培养基清洗细胞一次。

2. 400×g离心细胞5min,得到松散的细胞沉淀。

3. 细胞离心后,轻轻吸掉上清。注意不要移动任何细胞并且残留不超过25μl上清液。

4. 加1ml Diluent C到细胞沉淀中制备成2×细胞悬液,用枪轻轻吹匀以确保完全分散。不可涡旋和不可让细胞长期保留在Diluent C中。

5 染色前立即制备2×染色液(4μM in Diluent C):通过将4μl PKH67乙醇储存液到1ml Diluent C中,充分混匀分散所得。

6. 快速加1ml2×细胞悬液(Step 1.4)到1ml2×染色液(Step 1.5),用枪立即混匀样本。混匀后样本得到的终浓度是1×107个细胞/ml和2μM PKH67。

7. Step 1.6中的细胞/染料悬液孵育1-5min,中间定期混合。染色过程非常快,更长时间无任何益处。

8. 加入等体积(2ml)血清或其他适当蛋白溶液(比如1% BSA)终止染色,孵育1min允许结合多余的探针。

9. 20-25℃,400×g离心细胞10min,轻轻吸掉上清,确保不会移动细胞。用10ml完全培养基重悬细胞,转移到一个干净无菌的锥底聚丙烯离心管中,20-25℃,400×g离心细胞5min。然后用10ml完全培养基清洗细胞沉淀>2次,以确保完全去除未结合染料。

10. 最后一步清洗后,用10ml完全培养基重悬细胞沉淀,用来评估细胞回收,细胞活力和染色强度。离心和重悬沉淀到一理想终浓度的活细胞悬液。

染色示例(来自文献资源)

1)文献来源:Kelly DM, ten Bokum AM, O’Leary SM, O’Sullivan MP, Keane J. Bystander macrophage apoptosis after Mycobacterium tuberculosis H37Ra infection. Infect Immun. 2008;76(1):351-360. doi:10.1128/IAI.00614-07

PKH67染色目的(MKBIO):为了评估旁观者凋亡效应,靶向THP-1单核细胞用PKH67来标记,最终在荧光显微镜观察以确认标记是否成功。标记好的THP-1细胞(未感染的旁观者细胞量:0.5 × 105cells/ml),加入被H37Ra感染的THP-1巨噬细胞(感染效应细胞量:0.5 × 105cells/ml),接种到2孔的LabTek腔室玻片。效应巨噬细胞经H37Ra感染4h,之后剧烈清洗去除胞外细菌。之后与未感染的PKH67标记旁观者细胞共培养,37℃共培养24或48h。孵育后,上清液去除,细胞用2% PFA固定,然后用TUNEL TMR监测凋亡,细胞核用Hochest 33342复染。用荧光显微镜来评估绿色PKH67标记巨噬细胞的旁观凋亡效应。当某一个单细胞同时呈绿色(旁观者)和红色(凋亡),表明旁观者凋亡效应的存在。

Fig 2. Uninfected bystander apoptosis for macrophages that were in contact with infected macrophages. (A) Macrophages were infected for 4 h with M. tuberculosis strain H37Ra. Uninfected PKH67-labeled green THP-1 cells (0.5 × 105 cells/ml) were added to infected macrophages for 24 and 48 h. Adherent cells were then stained with Hoechst 33342 and with TUNEL TMR (red) to determine apoptosis levels. Superimposition of PKH67-labeled (green) bystander cell fields and TUNEL-positive (red) fields showed bystander apoptotic macrophages (orange). Nuclear staining (blue) (not shown) revealed the total number of cells per field. One representative field at a magnification of ×20 is shown. The arrows indicate apoptotic bystander macrophages. (B) Close-up of apoptotic bystander macrophage (arrow).

2)文献来源:Hellberg L, Fuchs S, Gericke C, et al. Proinflammatory stimuli enhance phagocytosis of apoptotic cells by neutrophil granulocytes. ScientificWorldJournal. 2011;11:2230-2236. doi:10.1100/2011/413271

PKH67染色目的(MKBIO):50ul肝素化全血用TLR-ligands和细胞因子刺激30min,之后,将1 × 106PKH67标记好的凋亡自体中性粒细胞加入全血中,置于37℃孵育。60min之后,红细胞用裂解液裂解掉,流式细胞术观察中性粒细胞内凋亡细胞的吞噬水平。

Fig 3. Phagocytosis of apoptotic neutrophils by neutrophils in whole blood. 50 μL heparinized whole blood was preincubated with the indicated stimuli for 30 min and, subsequently, 1 × 106 PKH67 stained apoptotic neutrophils were added. Phagocytosis was assessed after 60 min by using flow cytometry. (a) Effect of TLR-ligands on the phagocytosis rate. (b) Effect of various cytokines on the phagocytosis rate. Data show mean + SD from 3 independent experiments, *:P < 0.05. (c)–(f) Representative dot-plots for the quantitative assessment of ingestion of apoptotic cells by neutrophils in whole blood by using flow cytometry. (c) FSC/SSC gating of neutrophils. (d) Negative control: gated neutrophils without apoptotic cells. (e) neutrophil phagocytosis of PKH67-labeled (green) apoptotic neutrophils. (f) Neutrophil phagocytosis of PKH67-labeled (green) apoptotic neutrophils after exposure to Pam3CSK4.

相关产品

产品编号

产品名称 规格                  

MX3010-500T

CFDA SE Cell Proliferation and Cell Tracking Kit                         500T
MX3009-5MG CFDA, SE细胞增殖示踪荧光探针

5mg

MX3012-500T      

Calcein AM/PI Double Stain Kit活细胞/死细胞双染试剂盒 500T

MX3011-50UG

Calcein, AM, Ultra Pure Grade钙黄绿素(绿色)

50μg

MX4021-100UL PKH26 Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling

PKH26细胞连接试剂盒(用于常规细胞膜标记)

100μl

MX4022-10ML

Diluent C for General Membrane Labeling稀释液C 10ml
MX4023-100UL PKH67 Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling

PKH67细胞连接试剂盒(用于常规细胞膜标记)

100μl

MX4007-50UG

Celltracker CM-DiI活细胞示踪剂CM-DiI(红色) 1×50μg
MX4001-10MG DiO (DiOC18(3))细胞膜绿色荧光探针

10mg

MX4002-10MG DiI (DiIC18(3))细胞膜橙红色荧光探针

10mg

 

PKH67细胞连接试剂盒(用于常规细胞膜标记)


描述

PKH67细胞连接试剂盒(用于常规细胞膜标记)

产品关键词:

PKH67;PKH26;Calcein AM钙黄绿素;PKH67;CFDA SE;In vivo cell tracking体内细胞示踪;Sigma MINI26;Phanos Technologies;

产品信息

产品名称

产品编号               规格   价格(元)      

PKH67 Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling     

PKH67细胞连接试剂盒(用于常规细胞膜标记)

MX4023-100UL

100μl 996
MX4023-200UL 200μl

1946

MX4023-500UL 500μl

3886

【好消息】:应客户的要求,我司对试剂盒内的Diluent C可单独供应,产品信息如下:

产品名称

产品编号                 规格                    价格(元)          

Diluent C for General Membrane Labeling

稀释液C(用于常规细胞膜标记)

MX4022-10ML

10ml

296

MX4022-30ML 30ml

586

产品描述

PKH67细胞连接试剂盒(用于常规细胞膜标记)(PKH67 Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling)是一款基于荧光探针PKH67,用于常规细胞膜标记的检测试剂盒,适用于体外细胞标记,体外细胞增殖以及长期的体内细胞跟踪研究等。

PKH67是一种专利的膜标记探针,与PKH1和PKH2相比,结构上带有更长的脂肪族碳尾,能稳定插入细胞膜脂质区域。正因具更长碳尾,内部数据连续性证明:PKH67具有比PKH2更低的细胞-细胞间转运发生。PKH67呈绿色荧光(见图1),最大激发波长为490nm,最大发射波长是502nm,与标准荧光素(Fluorescein)滤片兼容。PKH67非常适合用于细胞毒性实验,与碘化丙啶(PI,MX4205)或7-氨基放线菌素D(7-AAD,MX4215)这些细胞活力探针联合使用,或者与橙-红色荧光探针比如藻红蛋白(PE,MX4698)、红色荧光蛋白(RFP)等结合使用。根据染料稀释原理,PKH67常用于细胞增殖监测分析,包括抗原特异性的前体频率和带干细胞特性的静息/缓慢分化肿瘤细胞的鉴定。也能用于监测外泌体或脂质体吞噬,细胞-细胞膜转运、吞噬、抗原递呈,以及体内细胞运输研究。

以不分裂细胞为研究对象,通过对体外细胞膜滞留周期和体内荧光强度减弱频率的关联性分析,预测PKH67的体内荧光半衰期为10-12天。这与PKH1和PKH2的体内半衰期相近,这两个探针都成功用于监测周期长达1-2个月的体内淋巴细胞和巨噬细胞运输研究,因此,PKH67适用于需要绿色荧光细胞连接染料的短-中期体内示踪研究,以及体外细胞毒性、吞噬、增殖、抗原递呈,或其它共培养实验。

稀释液C(Diluent C)是本试剂盒配套提供的一种水溶性溶液,特别设计的一种标记媒介能维持细胞活力,同时最大化染料溶解性和标记过程中的染色效率。Diluent C对哺乳动物细胞来说是等渗的,不含去污剂或有机溶剂,也不含生理盐和缓冲剂。根据细胞类型,染料标记后膜的内在化程度,标记细胞可能呈现不同的状态,从明亮,到均匀点状或斑驳状。然而,PKH67荧光在生理范围内不依赖于pH,且每个细胞的荧光强度通常不受染料位置的影响。

图1. PKH67的激发和发射光谱图

我司(金畔生物)提供三种规格的PKH67细胞连接试剂盒(用于常规细胞膜标记),其中:

Mini Kit(CAT#:MX4023-100UL)建议用于小量或初步研究。当使用2ml染色体积(含2μM终浓度的PKH67),本试剂盒含有足量的染料用于检测25次细胞样本(2×107个细胞/次),和足量的Diluent C用于5次细胞样本(2×107个细胞/次)。用户需根据细胞类型和实验目的来优化确定最佳的染料浓度。

Midi Kit(CAT#:MX4023-200UL)适用于中量研究,比如体外细胞增殖或毒性研究。当使用2ml染色体积(含2μM终浓度的PKH67),本试剂盒含有足量的染料用于检测50次细胞样本(2×107个细胞/次),和足量的Diluent C用于30次细胞样本(2×107个细胞/次)。用户需根据细胞类型和实验目的来优化确定最佳的染料浓度。

Maxi Kit(CAT#:MX4021-500UL)适用于大量或体内研究。当使用2ml染色体积(含2μM终浓度的PKH67),本试剂盒含有足量的染料用于检测125次细胞样本(2×107个细胞/次),和足量的Diluent C用于30次细胞样本(2×107个细胞/次)。用户需根据细胞类型和实验目的来优化确定最佳的染料浓度。

产品包装

组分

名称

货号(规格)

MX4023-100UL     

MX4023-200UL     MX4023-500UL     
MX4023-A      PKH67 Dye (1×10-3M in EtOH)     1×100μl 2×100μl

1×500μl

MX4023-B Diluent C 1×10ml 2×30ml

2×30ml

保存与运输方法

保存:2-8ºC避光保存,1年有效。其中组分A(PKH67 Dye)需严格避光,盖子保持拧紧。

运输:冰袋运输。

注意事项

  1. PKH67是以溶于乙醇的储存液形式提供,保存的过程中需避光并拧紧盖子,以防止溶液挥发引起的染料浓度提高。使用前需检查是否有结晶,若有结晶,需在37℃水浴溶晶,超声或涡旋直至完全溶解。
  2. Diluent C使用前需置于室温回温之后再配制标记用的细胞和染料工作液。Diluent C是无菌溶液,不含任何防腐剂或抗生素,使用和保存过程中都注意无菌。
  3. PKH67不能保存在Diluent C内,保存在Diluent C的染色工作液需在使用前配制,现配现用。
  4. 荧光染料均存在淬灭问题,操作和储存过程中需注意避光,以减缓荧光淬灭。
  5. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

操作步骤

1. 自行准备仪器和试剂(试剂盒不提供,用于常规细胞膜标记)

﹒良好分散,均匀的单细胞悬液(悬浮于组织培养基)

﹒含血清的组织培养基(完全培养基)

﹒不含Ca2+、Mg2+和血清的培养基,或生理盐溶液(比如,DPBS或HBSS)

﹒血清,白蛋白或其他系统兼容的蛋白

﹒聚丙烯锥底离心管(4-15ml)

﹒能控温的离心机(高达1000×g)

﹒荧光分析用仪器(荧光酶标板,荧光或共聚焦显微镜,流式细胞仪)

﹒无菌层流净化罩

﹒血球计数板或自动细胞计数装置

﹒载玻片和盖玻片

2. 常规细胞膜标记

【染色流程】:

以下操作流程使用2ml最终染色体积,含2μM PKH67,以及1×107个细胞/ml。

以下所有步骤都在室温下进行(20-25℃)。

1. 取一锥底聚丙烯离心管制备2×107个细胞的单细胞悬浮液,用无血清培养基清洗细胞一次。

2. 400×g离心细胞5min,得到松散的细胞沉淀。

3. 细胞离心后,轻轻吸掉上清。注意不要移动任何细胞并且残留不超过25μl上清液。

4. 加1ml Diluent C到细胞沉淀中制备成2×细胞悬液,用枪轻轻吹匀以确保完全分散。不可涡旋和不可让细胞长期保留在Diluent C中。

5 染色前立即制备2×染色液(4μM in Diluent C):通过将4μl PKH67乙醇储存液到1ml Diluent C中,充分混匀分散所得。

6. 快速加1ml2×细胞悬液(Step 1.4)到1ml2×染色液(Step 1.5),用枪立即混匀样本。混匀后样本得到的终浓度是1×107个细胞/ml和2μM PKH67。

7. Step 1.6中的细胞/染料悬液孵育1-5min,中间定期混合。染色过程非常快,更长时间无任何益处。

8. 加入等体积(2ml)血清或其他适当蛋白溶液(比如1% BSA)终止染色,孵育1min允许结合多余的探针。

9. 20-25℃,400×g离心细胞10min,轻轻吸掉上清,确保不会移动细胞。用10ml完全培养基重悬细胞,转移到一个干净无菌的锥底聚丙烯离心管中,20-25℃,400×g离心细胞5min。然后用10ml完全培养基清洗细胞沉淀>2次,以确保完全去除未结合染料。

10. 最后一步清洗后,用10ml完全培养基重悬细胞沉淀,用来评估细胞回收,细胞活力和染色强度。离心和重悬沉淀到一理想终浓度的活细胞悬液。

染色示例(来自文献资源)

1)文献来源:Kelly DM, ten Bokum AM, O’Leary SM, O’Sullivan MP, Keane J. Bystander macrophage apoptosis after Mycobacterium tuberculosis H37Ra infection. Infect Immun. 2008;76(1):351-360. doi:10.1128/IAI.00614-07

PKH67染色目的(MKBIO):为了评估旁观者凋亡效应,靶向THP-1单核细胞用PKH67来标记,最终在荧光显微镜观察以确认标记是否成功。标记好的THP-1细胞(未感染的旁观者细胞量:0.5 × 105cells/ml),加入被H37Ra感染的THP-1巨噬细胞(感染效应细胞量:0.5 × 105cells/ml),接种到2孔的LabTek腔室玻片。效应巨噬细胞经H37Ra感染4h,之后剧烈清洗去除胞外细菌。之后与未感染的PKH67标记旁观者细胞共培养,37℃共培养24或48h。孵育后,上清液去除,细胞用2% PFA固定,然后用TUNEL TMR监测凋亡,细胞核用Hochest 33342复染。用荧光显微镜来评估绿色PKH67标记巨噬细胞的旁观凋亡效应。当某一个单细胞同时呈绿色(旁观者)和红色(凋亡),表明旁观者凋亡效应的存在。

Fig 2. Uninfected bystander apoptosis for macrophages that were in contact with infected macrophages. (A) Macrophages were infected for 4 h with M. tuberculosis strain H37Ra. Uninfected PKH67-labeled green THP-1 cells (0.5 × 105 cells/ml) were added to infected macrophages for 24 and 48 h. Adherent cells were then stained with Hoechst 33342 and with TUNEL TMR (red) to determine apoptosis levels. Superimposition of PKH67-labeled (green) bystander cell fields and TUNEL-positive (red) fields showed bystander apoptotic macrophages (orange). Nuclear staining (blue) (not shown) revealed the total number of cells per field. One representative field at a magnification of ×20 is shown. The arrows indicate apoptotic bystander macrophages. (B) Close-up of apoptotic bystander macrophage (arrow).

2)文献来源:Hellberg L, Fuchs S, Gericke C, et al. Proinflammatory stimuli enhance phagocytosis of apoptotic cells by neutrophil granulocytes. ScientificWorldJournal. 2011;11:2230-2236. doi:10.1100/2011/413271

PKH67染色目的(MKBIO):50ul肝素化全血用TLR-ligands和细胞因子刺激30min,之后,将1 × 106PKH67标记好的凋亡自体中性粒细胞加入全血中,置于37℃孵育。60min之后,红细胞用裂解液裂解掉,流式细胞术观察中性粒细胞内凋亡细胞的吞噬水平。

Fig 3. Phagocytosis of apoptotic neutrophils by neutrophils in whole blood. 50 μL heparinized whole blood was preincubated with the indicated stimuli for 30 min and, subsequently, 1 × 106 PKH67 stained apoptotic neutrophils were added. Phagocytosis was assessed after 60 min by using flow cytometry. (a) Effect of TLR-ligands on the phagocytosis rate. (b) Effect of various cytokines on the phagocytosis rate. Data show mean + SD from 3 independent experiments, *:P < 0.05. (c)–(f) Representative dot-plots for the quantitative assessment of ingestion of apoptotic cells by neutrophils in whole blood by using flow cytometry. (c) FSC/SSC gating of neutrophils. (d) Negative control: gated neutrophils without apoptotic cells. (e) neutrophil phagocytosis of PKH67-labeled (green) apoptotic neutrophils. (f) Neutrophil phagocytosis of PKH67-labeled (green) apoptotic neutrophils after exposure to Pam3CSK4.

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MX3010-500T

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MX3012-500T      

Calcein AM/PI Double Stain Kit活细胞/死细胞双染试剂盒 500T

MX3011-50UG

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50μg

MX4021-100UL PKH26 Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling

PKH26细胞连接试剂盒(用于常规细胞膜标记)

100μl

MX4022-10ML

Diluent C for General Membrane Labeling稀释液C 10ml
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PKH67细胞连接试剂盒(用于常规细胞膜标记)

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10mg

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10mg

 

PKH67细胞连接试剂盒(用于常规细胞膜标记)


描述

PKH67细胞连接试剂盒(用于常规细胞膜标记)

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产品信息

产品名称

产品编号               规格   价格(元)      

PKH67 Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling     

PKH67细胞连接试剂盒(用于常规细胞膜标记)

MX4023-100UL

100μl 996
MX4023-200UL 200μl

1946

MX4023-500UL 500μl

3886

【好消息】:应客户的要求,我司对试剂盒内的Diluent C可单独供应,产品信息如下:

产品名称

产品编号                 规格                    价格(元)          

Diluent C for General Membrane Labeling

稀释液C(用于常规细胞膜标记)

MX4022-10ML

10ml

296

MX4022-30ML 30ml

586

产品描述

PKH67细胞连接试剂盒(用于常规细胞膜标记)(PKH67 Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling)是一款基于荧光探针PKH67,用于常规细胞膜标记的检测试剂盒,适用于体外细胞标记,体外细胞增殖以及长期的体内细胞跟踪研究等。

PKH67是一种专利的膜标记探针,与PKH1和PKH2相比,结构上带有更长的脂肪族碳尾,能稳定插入细胞膜脂质区域。正因具更长碳尾,内部数据连续性证明:PKH67具有比PKH2更低的细胞-细胞间转运发生。PKH67呈绿色荧光(见图1),最大激发波长为490nm,最大发射波长是502nm,与标准荧光素(Fluorescein)滤片兼容。PKH67非常适合用于细胞毒性实验,与碘化丙啶(PI,MX4205)或7-氨基放线菌素D(7-AAD,MX4215)这些细胞活力探针联合使用,或者与橙-红色荧光探针比如藻红蛋白(PE,MX4698)、红色荧光蛋白(RFP)等结合使用。根据染料稀释原理,PKH67常用于细胞增殖监测分析,包括抗原特异性的前体频率和带干细胞特性的静息/缓慢分化肿瘤细胞的鉴定。也能用于监测外泌体或脂质体吞噬,细胞-细胞膜转运、吞噬、抗原递呈,以及体内细胞运输研究。

以不分裂细胞为研究对象,通过对体外细胞膜滞留周期和体内荧光强度减弱频率的关联性分析,预测PKH67的体内荧光半衰期为10-12天。这与PKH1和PKH2的体内半衰期相近,这两个探针都成功用于监测周期长达1-2个月的体内淋巴细胞和巨噬细胞运输研究,因此,PKH67适用于需要绿色荧光细胞连接染料的短-中期体内示踪研究,以及体外细胞毒性、吞噬、增殖、抗原递呈,或其它共培养实验。

稀释液C(Diluent C)是本试剂盒配套提供的一种水溶性溶液,特别设计的一种标记媒介能维持细胞活力,同时最大化染料溶解性和标记过程中的染色效率。Diluent C对哺乳动物细胞来说是等渗的,不含去污剂或有机溶剂,也不含生理盐和缓冲剂。根据细胞类型,染料标记后膜的内在化程度,标记细胞可能呈现不同的状态,从明亮,到均匀点状或斑驳状。然而,PKH67荧光在生理范围内不依赖于pH,且每个细胞的荧光强度通常不受染料位置的影响。

图1. PKH67的激发和发射光谱图

我司(金畔生物)提供三种规格的PKH67细胞连接试剂盒(用于常规细胞膜标记),其中:

Mini Kit(CAT#:MX4023-100UL)建议用于小量或初步研究。当使用2ml染色体积(含2μM终浓度的PKH67),本试剂盒含有足量的染料用于检测25次细胞样本(2×107个细胞/次),和足量的Diluent C用于5次细胞样本(2×107个细胞/次)。用户需根据细胞类型和实验目的来优化确定最佳的染料浓度。

Midi Kit(CAT#:MX4023-200UL)适用于中量研究,比如体外细胞增殖或毒性研究。当使用2ml染色体积(含2μM终浓度的PKH67),本试剂盒含有足量的染料用于检测50次细胞样本(2×107个细胞/次),和足量的Diluent C用于30次细胞样本(2×107个细胞/次)。用户需根据细胞类型和实验目的来优化确定最佳的染料浓度。

Maxi Kit(CAT#:MX4021-500UL)适用于大量或体内研究。当使用2ml染色体积(含2μM终浓度的PKH67),本试剂盒含有足量的染料用于检测125次细胞样本(2×107个细胞/次),和足量的Diluent C用于30次细胞样本(2×107个细胞/次)。用户需根据细胞类型和实验目的来优化确定最佳的染料浓度。

产品包装

组分

名称

货号(规格)

MX4023-100UL     

MX4023-200UL     MX4023-500UL     
MX4023-A      PKH67 Dye (1×10-3M in EtOH)     1×100μl 2×100μl

1×500μl

MX4023-B Diluent C 1×10ml 2×30ml

2×30ml

保存与运输方法

保存:2-8ºC避光保存,1年有效。其中组分A(PKH67 Dye)需严格避光,盖子保持拧紧。

运输:冰袋运输。

注意事项

  1. PKH67是以溶于乙醇的储存液形式提供,保存的过程中需避光并拧紧盖子,以防止溶液挥发引起的染料浓度提高。使用前需检查是否有结晶,若有结晶,需在37℃水浴溶晶,超声或涡旋直至完全溶解。
  2. Diluent C使用前需置于室温回温之后再配制标记用的细胞和染料工作液。Diluent C是无菌溶液,不含任何防腐剂或抗生素,使用和保存过程中都注意无菌。
  3. PKH67不能保存在Diluent C内,保存在Diluent C的染色工作液需在使用前配制,现配现用。
  4. 荧光染料均存在淬灭问题,操作和储存过程中需注意避光,以减缓荧光淬灭。
  5. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

操作步骤

1. 自行准备仪器和试剂(试剂盒不提供,用于常规细胞膜标记)

﹒良好分散,均匀的单细胞悬液(悬浮于组织培养基)

﹒含血清的组织培养基(完全培养基)

﹒不含Ca2+、Mg2+和血清的培养基,或生理盐溶液(比如,DPBS或HBSS)

﹒血清,白蛋白或其他系统兼容的蛋白

﹒聚丙烯锥底离心管(4-15ml)

﹒能控温的离心机(高达1000×g)

﹒荧光分析用仪器(荧光酶标板,荧光或共聚焦显微镜,流式细胞仪)

﹒无菌层流净化罩

﹒血球计数板或自动细胞计数装置

﹒载玻片和盖玻片

2. 常规细胞膜标记

【染色流程】:

以下操作流程使用2ml最终染色体积,含2μM PKH67,以及1×107个细胞/ml。

以下所有步骤都在室温下进行(20-25℃)。

1. 取一锥底聚丙烯离心管制备2×107个细胞的单细胞悬浮液,用无血清培养基清洗细胞一次。

2. 400×g离心细胞5min,得到松散的细胞沉淀。

3. 细胞离心后,轻轻吸掉上清。注意不要移动任何细胞并且残留不超过25μl上清液。

4. 加1ml Diluent C到细胞沉淀中制备成2×细胞悬液,用枪轻轻吹匀以确保完全分散。不可涡旋和不可让细胞长期保留在Diluent C中。

5 染色前立即制备2×染色液(4μM in Diluent C):通过将4μl PKH67乙醇储存液到1ml Diluent C中,充分混匀分散所得。

6. 快速加1ml2×细胞悬液(Step 1.4)到1ml2×染色液(Step 1.5),用枪立即混匀样本。混匀后样本得到的终浓度是1×107个细胞/ml和2μM PKH67。

7. Step 1.6中的细胞/染料悬液孵育1-5min,中间定期混合。染色过程非常快,更长时间无任何益处。

8. 加入等体积(2ml)血清或其他适当蛋白溶液(比如1% BSA)终止染色,孵育1min允许结合多余的探针。

9. 20-25℃,400×g离心细胞10min,轻轻吸掉上清,确保不会移动细胞。用10ml完全培养基重悬细胞,转移到一个干净无菌的锥底聚丙烯离心管中,20-25℃,400×g离心细胞5min。然后用10ml完全培养基清洗细胞沉淀>2次,以确保完全去除未结合染料。

10. 最后一步清洗后,用10ml完全培养基重悬细胞沉淀,用来评估细胞回收,细胞活力和染色强度。离心和重悬沉淀到一理想终浓度的活细胞悬液。

染色示例(来自文献资源)

1)文献来源:Kelly DM, ten Bokum AM, O’Leary SM, O’Sullivan MP, Keane J. Bystander macrophage apoptosis after Mycobacterium tuberculosis H37Ra infection. Infect Immun. 2008;76(1):351-360. doi:10.1128/IAI.00614-07

PKH67染色目的(MKBIO):为了评估旁观者凋亡效应,靶向THP-1单核细胞用PKH67来标记,最终在荧光显微镜观察以确认标记是否成功。标记好的THP-1细胞(未感染的旁观者细胞量:0.5 × 105cells/ml),加入被H37Ra感染的THP-1巨噬细胞(感染效应细胞量:0.5 × 105cells/ml),接种到2孔的LabTek腔室玻片。效应巨噬细胞经H37Ra感染4h,之后剧烈清洗去除胞外细菌。之后与未感染的PKH67标记旁观者细胞共培养,37℃共培养24或48h。孵育后,上清液去除,细胞用2% PFA固定,然后用TUNEL TMR监测凋亡,细胞核用Hochest 33342复染。用荧光显微镜来评估绿色PKH67标记巨噬细胞的旁观凋亡效应。当某一个单细胞同时呈绿色(旁观者)和红色(凋亡),表明旁观者凋亡效应的存在。

Fig 2. Uninfected bystander apoptosis for macrophages that were in contact with infected macrophages. (A) Macrophages were infected for 4 h with M. tuberculosis strain H37Ra. Uninfected PKH67-labeled green THP-1 cells (0.5 × 105 cells/ml) were added to infected macrophages for 24 and 48 h. Adherent cells were then stained with Hoechst 33342 and with TUNEL TMR (red) to determine apoptosis levels. Superimposition of PKH67-labeled (green) bystander cell fields and TUNEL-positive (red) fields showed bystander apoptotic macrophages (orange). Nuclear staining (blue) (not shown) revealed the total number of cells per field. One representative field at a magnification of ×20 is shown. The arrows indicate apoptotic bystander macrophages. (B) Close-up of apoptotic bystander macrophage (arrow).

2)文献来源:Hellberg L, Fuchs S, Gericke C, et al. Proinflammatory stimuli enhance phagocytosis of apoptotic cells by neutrophil granulocytes. ScientificWorldJournal. 2011;11:2230-2236. doi:10.1100/2011/413271

PKH67染色目的(MKBIO):50ul肝素化全血用TLR-ligands和细胞因子刺激30min,之后,将1 × 106PKH67标记好的凋亡自体中性粒细胞加入全血中,置于37℃孵育。60min之后,红细胞用裂解液裂解掉,流式细胞术观察中性粒细胞内凋亡细胞的吞噬水平。

Fig 3. Phagocytosis of apoptotic neutrophils by neutrophils in whole blood. 50 μL heparinized whole blood was preincubated with the indicated stimuli for 30 min and, subsequently, 1 × 106 PKH67 stained apoptotic neutrophils were added. Phagocytosis was assessed after 60 min by using flow cytometry. (a) Effect of TLR-ligands on the phagocytosis rate. (b) Effect of various cytokines on the phagocytosis rate. Data show mean + SD from 3 independent experiments, *:P < 0.05. (c)–(f) Representative dot-plots for the quantitative assessment of ingestion of apoptotic cells by neutrophils in whole blood by using flow cytometry. (c) FSC/SSC gating of neutrophils. (d) Negative control: gated neutrophils without apoptotic cells. (e) neutrophil phagocytosis of PKH67-labeled (green) apoptotic neutrophils. (f) Neutrophil phagocytosis of PKH67-labeled (green) apoptotic neutrophils after exposure to Pam3CSK4.

相关产品

产品编号

产品名称 规格                  

MX3010-500T

CFDA SE Cell Proliferation and Cell Tracking Kit                         500T
MX3009-5MG CFDA, SE细胞增殖示踪荧光探针

5mg

MX3012-500T      

Calcein AM/PI Double Stain Kit活细胞/死细胞双染试剂盒 500T

MX3011-50UG

Calcein, AM, Ultra Pure Grade钙黄绿素(绿色)

50μg

MX4021-100UL PKH26 Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling

PKH26细胞连接试剂盒(用于常规细胞膜标记)

100μl

MX4022-10ML

Diluent C for General Membrane Labeling稀释液C 10ml
MX4023-100UL PKH67 Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling

PKH67细胞连接试剂盒(用于常规细胞膜标记)

100μl

MX4007-50UG

Celltracker CM-DiI活细胞示踪剂CM-DiI(红色) 1×50μg
MX4001-10MG DiO (DiOC18(3))细胞膜绿色荧光探针

10mg

MX4002-10MG DiI (DiIC18(3))细胞膜橙红色荧光探针

10mg

 

PKH26 Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling PKH26细胞连接试剂盒(用于常规细胞膜标记)


描述

PKH26 细胞连接试剂盒(用于常规细胞膜标记)

产品关键词:

PKH26;Calcein AM钙黄绿素;PKH67;CFDA SE;In vivo cell tracking 体内细胞示踪;Sigma MINI26;Phanos Technologies;

产品信息

产品名称 产品编号 规格              价格(元)    
PKH26 Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling       

PKH26细胞连接试剂盒(用于常规细胞膜标记)

MX4021-100UL      100μl 996
MX4021-200UL 200μl 1946
MX4021-500UL 500μl 3886

【好消息】:应客户的要求,我司对试剂盒内的Diluent C可单独供应,产品信息如下:

产品名称 产品编号 规格              价格(元)    
Diluent C for General Membrane Labeling                                

稀释液C(用于常规细胞膜标记)

MX4022-10ML        10ml 296
MX4022-30ML 30ml 586

产品描述

PKH26细胞连接试剂盒(用于常规细胞膜标记)(PKH26 Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling)是一款基于荧光探针PKH26,用于常规细胞膜标记的检测试剂盒,适用于体外细胞标记,体外细胞增殖以及长期的体内细胞跟踪研究等。

PKH26是一种专利的膜标记探针,结构上带有一长脂肪族尾巴,能稳定插入细胞膜脂质区域。PKH26荧光处于黄-橙色光谱区间(见图1),最大激发波长为551nm,最大发射波长是567nm,与罗丹明或PE检测系统兼容。也可能用标准荧光素(Fluorescein)激发滤片,但荧光强度可能会有些降低。PKH26具最长的体内半衰期,超过100天,非常适用于体内细胞示踪、细胞增殖研究和其他长期实验。

稀释液C(Diluent C)是本试剂盒配套提供的一种水溶性溶液,特别设计的一种标记媒介能维持细胞活力,同时最大化染料溶解性和标记过程中的染色效率。Diluent C对哺乳动物细胞来说是等渗的,不含去污剂或有机溶剂,也不含生理盐和缓冲剂。根据细胞类型,染料标记后膜的内在化程度,标记细胞可能呈现不同的状态,从明亮,到均匀点状或斑驳状。然而,PKH26荧光在生理范围内不依赖于pH,且每个细胞的荧光强度通常不受染料位置的影响。

图1. PKH26的激发和发射光谱图

我司(金畔生物)提供三种规格的PKH26细胞连接试剂盒(用于常规细胞膜标记),其中:

Mini Kit(CAT#:MX4021-100UL)建议用于小量或初步研究。当使用2ml染色体积(含2μM 终浓度的PKH26),本试剂盒含有足量的染料用于检测25次细胞样本(2×107个细胞/次),和足量的Diluent C用于5次细胞样本(2×107个细胞/次)。用户需根据细胞类型和实验目的来优化确定最佳的染料浓度。

Midi Kit(CAT#:MX4021-200UL)适用于中量研究。当使用2ml染色体积(含2μM 终浓度的PKH26),本试剂盒含有足量的染料用于检测50次细胞样本(2×107个细胞/次),和足量的Diluent C用于30次细胞样本(2×107个细胞/次)。用户需根据细胞类型和实验目的来优化确定最佳的染料浓度。

Maxi Kit(CAT#:MX4021-500UL)适用于大量或体内研究。当使用2ml染色体积(含2μM 终浓度的PKH26),本试剂盒含有足量的染料用于检测125次细胞样本(2×107个细胞/次),和足量的Diluent C用于30次细胞样本(2×107个细胞/次)。用户需根据细胞类型和实验目的来优化确定最佳的染料浓度

产品包装

组分             名称

货号(规格)

MX4021-100UL     MX4021-200UL   MX4021-500UL  
MX4021-A PKH26 Dye (1×10-3M in EtOH)      1×100μl 2×100μl 5×100μl
MX4021-B Diluent C 1×10ml 2×30ml 2×30ml

保存与运输方法

保存:2-8ºC避光保存,1年有效。其中组分A(PKH26 Dye)需严格避光,盖子保持拧紧。

运输:冰袋运输。

注意事项

1)   PKH26是以溶于乙醇的储存液形式提供,保存的过程中需避光并拧紧盖子,以防止溶液挥发引起的染料浓度提高。使用前需检查是否有结晶,若有结晶,需在37℃水浴溶晶,超声或涡旋直至完全溶解。

2)   Diluent C使用前需置于室温回温之后再配制标记用的细胞和染料工作液。Diluent C是无菌溶液,不含任何防腐剂或抗生素,使用和保存过程中都注意无菌。

3)   PKH26不能保存在Diluent C内,保存在Diluent C的染色工作液需在使用前配制,现配现用。

4)   荧光染料均存在淬灭问题,操作和储存过程中需注意避光,以减缓荧光淬灭。

5)   为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

操作步骤

一、 自行准备仪器和试剂(试剂盒不提供,用于常规细胞膜标记)

﹒良好分散,均匀的单细胞悬液(悬浮于组织培养基)

﹒含血清的组织培养基(完全培养基)

﹒不含Ca2+、Mg2+和血清的培养基,或生理盐溶液(比如,DPBS或HBSS)

﹒血清,白蛋白或其他系统兼容的蛋白

﹒聚丙烯锥底离心管(4-15ml)

﹒能控温的离心机(高达1000×g)

﹒荧光分析用仪器(荧光酶标板,荧光或共聚焦显微镜,流式细胞仪)

﹒无菌层流净化罩

﹒血球计数板或自动细胞计数装置

﹒载玻片和盖玻片

二、 常规细胞膜标记

【注意事项】:

1)   通过分配脂质染料进入细胞膜来进行标记。标记强度是染料浓度和细胞浓度共同作用的一种功能,且不会饱和。因此,用来标记的染料浓度需要有限,过度标记细胞会引起细胞膜完整性丧失和降低的细胞复原能力。

2)   以下步骤适用于体外或离体标记干细胞、淋巴细胞、单个核细胞、内皮细胞、神经元或任何需要将染料插入细胞膜脂质区的其他细胞类型。而体内标记、血小板标记,或在含非吞噬细胞的群体内选择性标记吞噬细胞,需对步骤做适当修改。

3)   需在单克隆抗体染色前进行常规细胞膜染色。4℃单克隆抗体染色过程中膜染料仍能维持稳定。然而,如果单抗标记后再室温下进行常规细胞膜染色,极有可能引起单抗的“盖帽”发生。

4)   以下步骤中用到的细胞和染料浓度是推荐用的起始浓度,广谱适用于各种细胞类型。用户需根据自身细胞类型和实验目的确定最佳的染料和细胞浓度,通过对染色后细胞活力(比如碘化丙啶排斥),荧光强度,染色均匀性和对待研究细胞功能无影响等方面来综合评估。

5)   PKH26染色过程中需避免叠氮化物或代谢毒物的存在。

6)   虽然粘附在固相基质上的贴壁细胞可能被标记,使用单细胞悬浮液能得到更匀质的染色结果。染色前使用蛋白消化酶比如胰酶/EDTA处理贴壁或结合细胞制备成分散的单细胞悬液能得到最好的染色结果。

【染色流程】:

以下操作流程使用2ml最终染色体积,含2μM PKH26,以及1×107个细胞/ml。

以下所有步骤都在室温下进行(20-25℃)。

1.1    取一锥底聚丙烯离心管制备2×107个细胞的单细胞悬浮液,用无血清培养基清洗细胞一次。

【注意】:血清蛋白和脂质也会结合染料,降低用于膜标记的有效染料浓度。用无血清培养基或缓冲液(Step 1.1)清洗细胞一次,然后再用Diluent C重悬细胞用于标记能得到最佳结果。

1.2    400×g离心细胞5min,得到松散的细胞沉淀。【注意】:PKH26乙醇储存液不能直接加入细胞沉淀上,否则会引起异质染色和降低的细胞活力。

1.3    细胞离心后,轻轻吸掉上清。注意不要移动任何细胞并且残留不超过25μl上清液。

【注意】:为了得到重复性结果,最小化残留培养基或缓冲液很重要,然后再将细胞重悬在Diluent C中。

1.4    加1ml Diluent C到细胞沉淀中制备成2×细胞悬液,用枪轻轻吹匀以确保完全分散。不可涡旋和不可让细胞长期保留在Diluent C中。

【注意】:生理盐离子的存在导致染料形成胶团,实质上降低染色效率。因此,染料添加的时候细胞悬浮在Diluent C中很重要,而不是在培养基或缓冲盐溶液中。

1.5   染色前立即制备2×染色液(4μM in Diluent C):通过将4μl PKH26乙醇储存液到1ml Diluent C中,充分混匀分散所得。

【注意】:

a)为了最小化乙醇对细胞活力影响,Step 1.5中加入的染料体积产生占Step 1.6中不超过1-2%的乙醇量;b)若想得到<2μM的最终染料浓度,用未变性的100%无水乙醇稀释试剂盒提供的PKH26乙醇储存液到一中间染料浓度,能得到最好的重复染色结果。

1.6   快速加1ml 2×细胞悬液(Step 1.4)到1ml 2×染色液(Step 1.5),用枪立即混匀样本。混匀后样本得到的终浓度是1×107个细胞/ml 和2μM PKH26。

【注意】:由于染色几乎是一瞬间发生,在染色工作液中快速且均匀分散细胞对得到明亮、一致和重复的标记结果至关重要。以下措施都有利于得到优化结果:

a.       不要将PKH26乙醇储存液直接加到2×染色液(4μM in Diluent C)中。

b.       混匀等体积的2×细胞悬液(Step 1.4)和2×染色液(Step 1.5)。

c.       调整2×细胞悬液和2×染色液体积,避免在很小(<100μl)或很大(>5ml)体积。

d.       使用自动移液器或相同产品用于快速添加细胞和与染料混匀。血清学移液管很慢,得到相对更不一致的染色。“推压”或涡旋也很慢,得到相对更不一致染色。

e.       尽可能精确加量体积,为了精确重复每个样品间和每个研究间用到的细胞和染料浓度。

1.7    Step 1.6中的细胞/染料悬液孵育1-5min,中间定期混合。染色过程非常快,更长时间无任何益处。

【注意】:以获得理想染色结果的最短时间进行细胞孵育。由于Diluent C不含生理盐,更长的细胞孵育可能引起某些细胞类型活力降低。如果猜测可能有此效应产生,那么同时设置一个仅含Diluent的对照和一个使用乙醇染色而不是染料染色的阴性对照(mock-stained control)。

1.8    加入等体积(2ml)血清或其他适当蛋白溶液(比如1% BSA),孵育1min允许结合多余的探针。

【注意】:

a.血清(或等蛋白浓度溶液)更适合用作终止液。如果用完全培养基直接替代血清提高加入体积到10ml。

b. 在终止染色反应前不要通过加入Diluent C或离心细胞到Diluent C来终止。

c.不要使用无血清培养基或生理盐溶液,会引起细胞相关染料聚合物产生。染料聚合物好比未结合染料的“缓释水池”,通过清洗不能有效去除,且会转移到实验体系中的未标记细胞上。

1.9    20-25℃,400×g离心细胞10min,轻轻吸掉上清,确保不会移动细胞。用10ml完全培养基重悬细胞,转移到一个干净无菌的锥底聚丙烯离心管中,20-25℃,400×g离心细胞5min。然后用10ml完全培养基清洗细胞沉淀>2次,以确保完全去除未结合染料。

【注意】:转移到一干净离心管内能增加清洗效率,通过最小化结合到管壁上的残留染料的交叉污染;不要使用Diluent C用于清洗。

1.10  最后一步清洗后,用10ml完全培养基重悬细胞沉淀,用来评估细胞回收,细胞活力和染色强度。离心和重悬沉淀到一理想终浓度的活细胞悬液。

【注意】:

a.       染色细胞可能用1-2%中性缓冲甲醛固定,若样本避光保存荧光强度可稳定保存至少3周。

b.       染色通常比背景自荧光至少强100-1000倍。荧光分布必须匀称,且尽量均质,虽然染色CV取决于染色细胞类型。

PKH26客户使用案例(逐步增加中。。。。。。)

 图片描述:巨噬细胞(106个/mL)经PKH26(MKBio, 货号:MX4021-100UL,使用浓度:4uL/mL,5min)标记,荧光显微镜(Ex/Em=551nm/567nm)检测。【数据来源:华东理工大学药学院 李老师】

图片描述:斑马鱼体内给PKH26(MKBio,货号:MX4021-100UL)标记以及荧光成像。【数据来源:兰州大学医学院 潘老师

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MX3009-5MG CFDA, SE细胞增殖示踪荧光探针 5mg
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PKH26细胞连接试剂盒(用于常规细胞膜标记)

100μl
MX4007-50UG Celltracker CM-DiI 活细胞示踪剂CM-DiI(红色) 1×50μg
MX4001-10MG DiO (DiOC18(3))细胞膜绿色荧光探针 10mg
MX4002-10MG DiI (DiIC18(3))细胞膜橙红色荧光探针 10mg

 

 

PKH26细胞连接试剂盒 PKH26 Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling (用于常规细胞膜标记)


描述

PKH26 细胞连接试剂盒(用于常规细胞膜标记)

产品关键词:

PKH26;Calcein AM钙黄绿素;PKH67;CFDA SE;In vivo cell tracking 体内细胞示踪;Sigma MINI26;Phanos Technologies;

产品信息

产品名称 产品编号 规格              价格(元)    
PKH26 Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling       

PKH26细胞连接试剂盒(用于常规细胞膜标记)

MX4021-100UL      100μl 996
MX4021-200UL 200μl 1946
MX4021-500UL 500μl 3886

【好消息】:应客户的要求,我司对试剂盒内的Diluent C可单独供应,产品信息如下:

产品名称 产品编号 规格              价格(元)    
Diluent C for General Membrane Labeling                                

稀释液C(用于常规细胞膜标记)

MX4022-10ML        10ml 296
MX4022-30ML 30ml 586

产品描述

PKH26细胞连接试剂盒(用于常规细胞膜标记)(PKH26 Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling)是一款基于荧光探针PKH26,用于常规细胞膜标记的检测试剂盒,适用于体外细胞标记,体外细胞增殖以及长期的体内细胞跟踪研究等。

PKH26是一种专利的膜标记探针,结构上带有一长脂肪族尾巴,能稳定插入细胞膜脂质区域。PKH26荧光处于黄-橙色光谱区间(见图1),最大激发波长为551nm,最大发射波长是567nm,与罗丹明或PE检测系统兼容。也可能用标准荧光素(Fluorescein)激发滤片,但荧光强度可能会有些降低。PKH26具最长的体内半衰期,超过100天,非常适用于体内细胞示踪、细胞增殖研究和其他长期实验。

稀释液C(Diluent C)是本试剂盒配套提供的一种水溶性溶液,特别设计的一种标记媒介能维持细胞活力,同时最大化染料溶解性和标记过程中的染色效率。Diluent C对哺乳动物细胞来说是等渗的,不含去污剂或有机溶剂,也不含生理盐和缓冲剂。根据细胞类型,染料标记后膜的内在化程度,标记细胞可能呈现不同的状态,从明亮,到均匀点状或斑驳状。然而,PKH26荧光在生理范围内不依赖于pH,且每个细胞的荧光强度通常不受染料位置的影响。

图1. PKH26的激发和发射光谱图

我司(金畔生物)提供三种规格的PKH26细胞连接试剂盒(用于常规细胞膜标记),其中:

Mini Kit(CAT#:MX4021-100UL)建议用于小量或初步研究。当使用2ml染色体积(含2μM 终浓度的PKH26),本试剂盒含有足量的染料用于检测25次细胞样本(2×107个细胞/次),和足量的Diluent C用于5次细胞样本(2×107个细胞/次)。用户需根据细胞类型和实验目的来优化确定最佳的染料浓度。

Midi Kit(CAT#:MX4021-200UL)适用于中量研究。当使用2ml染色体积(含2μM 终浓度的PKH26),本试剂盒含有足量的染料用于检测50次细胞样本(2×107个细胞/次),和足量的Diluent C用于30次细胞样本(2×107个细胞/次)。用户需根据细胞类型和实验目的来优化确定最佳的染料浓度。

Maxi Kit(CAT#:MX4021-500UL)适用于大量或体内研究。当使用2ml染色体积(含2μM 终浓度的PKH26),本试剂盒含有足量的染料用于检测125次细胞样本(2×107个细胞/次),和足量的Diluent C用于30次细胞样本(2×107个细胞/次)。用户需根据细胞类型和实验目的来优化确定最佳的染料浓度

产品包装

组分             名称

货号(规格)

MX4021-100UL     MX4021-200UL   MX4021-500UL  
MX4021-A PKH26 Dye (1×10-3M in EtOH)      1×100μl 2×100μl 5×100μl
MX4021-B Diluent C 1×10ml 2×30ml 2×30ml

保存与运输方法

保存:2-8ºC避光保存,1年有效。其中组分A(PKH26 Dye)需严格避光,盖子保持拧紧。

运输:冰袋运输。

注意事项

1)   PKH26是以溶于乙醇的储存液形式提供,保存的过程中需避光并拧紧盖子,以防止溶液挥发引起的染料浓度提高。使用前需检查是否有结晶,若有结晶,需在37℃水浴溶晶,超声或涡旋直至完全溶解。

2)   Diluent C使用前需置于室温回温之后再配制标记用的细胞和染料工作液。Diluent C是无菌溶液,不含任何防腐剂或抗生素,使用和保存过程中都注意无菌。

3)   PKH26不能保存在Diluent C内,保存在Diluent C的染色工作液需在使用前配制,现配现用。

4)   荧光染料均存在淬灭问题,操作和储存过程中需注意避光,以减缓荧光淬灭。

5)   为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

操作步骤

一、 自行准备仪器和试剂(试剂盒不提供,用于常规细胞膜标记)

﹒良好分散,均匀的单细胞悬液(悬浮于组织培养基)

﹒含血清的组织培养基(完全培养基)

﹒不含Ca2+、Mg2+和血清的培养基,或生理盐溶液(比如,DPBS或HBSS)

﹒血清,白蛋白或其他系统兼容的蛋白

﹒聚丙烯锥底离心管(4-15ml)

﹒能控温的离心机(高达1000×g)

﹒荧光分析用仪器(荧光酶标板,荧光或共聚焦显微镜,流式细胞仪)

﹒无菌层流净化罩

﹒血球计数板或自动细胞计数装置

﹒载玻片和盖玻片

二、 常规细胞膜标记

【注意事项】:

1)   通过分配脂质染料进入细胞膜来进行标记。标记强度是染料浓度和细胞浓度共同作用的一种功能,且不会饱和。因此,用来标记的染料浓度需要有限,过度标记细胞会引起细胞膜完整性丧失和降低的细胞复原能力。

2)   以下步骤适用于体外或离体标记干细胞、淋巴细胞、单个核细胞、内皮细胞、神经元或任何需要将染料插入细胞膜脂质区的其他细胞类型。而体内标记、血小板标记,或在含非吞噬细胞的群体内选择性标记吞噬细胞,需对步骤做适当修改。

3)   需在单克隆抗体染色前进行常规细胞膜染色。4℃单克隆抗体染色过程中膜染料仍能维持稳定。然而,如果单抗标记后再室温下进行常规细胞膜染色,极有可能引起单抗的“盖帽”发生。

4)   以下步骤中用到的细胞和染料浓度是推荐用的起始浓度,广谱适用于各种细胞类型。用户需根据自身细胞类型和实验目的确定最佳的染料和细胞浓度,通过对染色后细胞活力(比如碘化丙啶排斥),荧光强度,染色均匀性和对待研究细胞功能无影响等方面来综合评估。

5)   PKH26染色过程中需避免叠氮化物或代谢毒物的存在。

6)   虽然粘附在固相基质上的贴壁细胞可能被标记,使用单细胞悬浮液能得到更匀质的染色结果。染色前使用蛋白消化酶比如胰酶/EDTA处理贴壁或结合细胞制备成分散的单细胞悬液能得到最好的染色结果。

【染色流程】:

以下操作流程使用2ml最终染色体积,含2μM PKH26,以及1×107个细胞/ml。

以下所有步骤都在室温下进行(20-25℃)。

1.1    取一锥底聚丙烯离心管制备2×107个细胞的单细胞悬浮液,用无血清培养基清洗细胞一次。

【注意】:血清蛋白和脂质也会结合染料,降低用于膜标记的有效染料浓度。用无血清培养基或缓冲液(Step 1.1)清洗细胞一次,然后再用Diluent C重悬细胞用于标记能得到最佳结果。

1.2    400×g离心细胞5min,得到松散的细胞沉淀。【注意】:PKH26乙醇储存液不能直接加入细胞沉淀上,否则会引起异质染色和降低的细胞活力。

1.3    细胞离心后,轻轻吸掉上清。注意不要移动任何细胞并且残留不超过25μl上清液。

【注意】:为了得到重复性结果,最小化残留培养基或缓冲液很重要,然后再将细胞重悬在Diluent C中。

1.4    加1ml Diluent C到细胞沉淀中制备成2×细胞悬液,用枪轻轻吹匀以确保完全分散。不可涡旋和不可让细胞长期保留在Diluent C中。

【注意】:生理盐离子的存在导致染料形成胶团,实质上降低染色效率。因此,染料添加的时候细胞悬浮在Diluent C中很重要,而不是在培养基或缓冲盐溶液中。

1.5   染色前立即制备2×染色液(4μM in Diluent C):通过将4μl PKH26乙醇储存液到1ml Diluent C中,充分混匀分散所得。

【注意】:

a)为了最小化乙醇对细胞活力影响,Step 1.5中加入的染料体积产生占Step 1.6中不超过1-2%的乙醇量;b)若想得到<2μM的最终染料浓度,用未变性的100%无水乙醇稀释试剂盒提供的PKH26乙醇储存液到一中间染料浓度,能得到最好的重复染色结果。

1.6   快速加1ml 2×细胞悬液(Step 1.4)到1ml 2×染色液(Step 1.5),用枪立即混匀样本。混匀后样本得到的终浓度是1×107个细胞/ml 和2μM PKH26。

【注意】:由于染色几乎是一瞬间发生,在染色工作液中快速且均匀分散细胞对得到明亮、一致和重复的标记结果至关重要。以下措施都有利于得到优化结果:

a.       不要将PKH26乙醇储存液直接加到2×染色液(4μM in Diluent C)中。

b.       混匀等体积的2×细胞悬液(Step 1.4)和2×染色液(Step 1.5)。

c.       调整2×细胞悬液和2×染色液体积,避免在很小(<100μl)或很大(>5ml)体积。

d.       使用自动移液器或相同产品用于快速添加细胞和与染料混匀。血清学移液管很慢,得到相对更不一致的染色。“推压”或涡旋也很慢,得到相对更不一致染色。

e.       尽可能精确加量体积,为了精确重复每个样品间和每个研究间用到的细胞和染料浓度。

1.7    Step 1.6中的细胞/染料悬液孵育1-5min,中间定期混合。染色过程非常快,更长时间无任何益处。

【注意】:以获得理想染色结果的最短时间进行细胞孵育。由于Diluent C不含生理盐,更长的细胞孵育可能引起某些细胞类型活力降低。如果猜测可能有此效应产生,那么同时设置一个仅含Diluent的对照和一个使用乙醇染色而不是染料染色的阴性对照(mock-stained control)。

1.8    加入等体积(2ml)血清或其他适当蛋白溶液(比如1% BSA),孵育1min允许结合多余的探针。

【注意】:

a.血清(或等蛋白浓度溶液)更适合用作终止液。如果用完全培养基直接替代血清提高加入体积到10ml。

b. 在终止染色反应前不要通过加入Diluent C或离心细胞到Diluent C来终止。

c.不要使用无血清培养基或生理盐溶液,会引起细胞相关染料聚合物产生。染料聚合物好比未结合染料的“缓释水池”,通过清洗不能有效去除,且会转移到实验体系中的未标记细胞上。

1.9    20-25℃,400×g离心细胞10min,轻轻吸掉上清,确保不会移动细胞。用10ml完全培养基重悬细胞,转移到一个干净无菌的锥底聚丙烯离心管中,20-25℃,400×g离心细胞5min。然后用10ml完全培养基清洗细胞沉淀>2次,以确保完全去除未结合染料。

【注意】:转移到一干净离心管内能增加清洗效率,通过最小化结合到管壁上的残留染料的交叉污染;不要使用Diluent C用于清洗。

1.10  最后一步清洗后,用10ml完全培养基重悬细胞沉淀,用来评估细胞回收,细胞活力和染色强度。离心和重悬沉淀到一理想终浓度的活细胞悬液。

【注意】:

a.       染色细胞可能用1-2%中性缓冲甲醛固定,若样本避光保存荧光强度可稳定保存至少3周。

b.       染色通常比背景自荧光至少强100-1000倍。荧光分布必须匀称,且尽量均质,虽然染色CV取决于染色细胞类型。

PKH26客户使用案例(逐步增加中。。。。。。)

 图片描述:巨噬细胞(106个/mL)经PKH26(MKBio, 货号:MX4021-100UL,使用浓度:4uL/mL,5min)标记,荧光显微镜(Ex/Em=551nm/567nm)检测。【数据来源:华东理工大学药学院 李老师】

图片描述:斑马鱼体内给PKH26(MKBio,货号:MX4021-100UL)标记以及荧光成像。【数据来源:兰州大学医学院 潘老师

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产品编号 产品名称 规格                
MX3010-500T CFDA SE Cell Proliferation and Cell Tracking Kit 500T
MX3009-5MG CFDA, SE细胞增殖示踪荧光探针 5mg
MX3012-500T Calcein AM/PI Double Stain Kit活细胞/死细胞双染试剂盒       500T
MX3011-50UG       Calcein, AM, Ultra Pure Grade钙黄绿素(绿色) 50μg
MX4021-100UL PKH26 Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling

PKH26细胞连接试剂盒(用于常规细胞膜标记)

100μl
MX4007-50UG Celltracker CM-DiI 活细胞示踪剂CM-DiI(红色) 1×50μg
MX4001-10MG DiO (DiOC18(3))细胞膜绿色荧光探针 10mg
MX4002-10MG DiI (DiIC18(3))细胞膜橙红色荧光探针 10mg

 

 

PKH26细胞连接试剂盒 PKH26 Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling (用于常规细胞膜标记)


描述

PKH26 细胞连接试剂盒(用于常规细胞膜标记)

产品关键词:

PKH26;Calcein AM钙黄绿素;PKH67;CFDA SE;In vivo cell tracking 体内细胞示踪;Sigma MINI26;Phanos Technologies;

产品信息

产品名称 产品编号 规格              价格(元)    
PKH26 Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling       

PKH26细胞连接试剂盒(用于常规细胞膜标记)

MX4021-100UL      100μl 996
MX4021-200UL 200μl 1946
MX4021-500UL 500μl 3886

【好消息】:应客户的要求,我司对试剂盒内的Diluent C可单独供应,产品信息如下:

产品名称 产品编号 规格              价格(元)    
Diluent C for General Membrane Labeling                                

稀释液C(用于常规细胞膜标记)

MX4022-10ML        10ml 296
MX4022-30ML 30ml 586

产品描述

PKH26细胞连接试剂盒(用于常规细胞膜标记)(PKH26 Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling)是一款基于荧光探针PKH26,用于常规细胞膜标记的检测试剂盒,适用于体外细胞标记,体外细胞增殖以及长期的体内细胞跟踪研究等。

PKH26是一种专利的膜标记探针,结构上带有一长脂肪族尾巴,能稳定插入细胞膜脂质区域。PKH26荧光处于黄-橙色光谱区间(见图1),最大激发波长为551nm,最大发射波长是567nm,与罗丹明或PE检测系统兼容。也可能用标准荧光素(Fluorescein)激发滤片,但荧光强度可能会有些降低。PKH26具最长的体内半衰期,超过100天,非常适用于体内细胞示踪、细胞增殖研究和其他长期实验。

稀释液C(Diluent C)是本试剂盒配套提供的一种水溶性溶液,特别设计的一种标记媒介能维持细胞活力,同时最大化染料溶解性和标记过程中的染色效率。Diluent C对哺乳动物细胞来说是等渗的,不含去污剂或有机溶剂,也不含生理盐和缓冲剂。根据细胞类型,染料标记后膜的内在化程度,标记细胞可能呈现不同的状态,从明亮,到均匀点状或斑驳状。然而,PKH26荧光在生理范围内不依赖于pH,且每个细胞的荧光强度通常不受染料位置的影响。

图1. PKH26的激发和发射光谱图

我司(金畔生物)提供三种规格的PKH26细胞连接试剂盒(用于常规细胞膜标记),其中:

Mini Kit(CAT#:MX4021-100UL)建议用于小量或初步研究。当使用2ml染色体积(含2μM 终浓度的PKH26),本试剂盒含有足量的染料用于检测25次细胞样本(2×107个细胞/次),和足量的Diluent C用于5次细胞样本(2×107个细胞/次)。用户需根据细胞类型和实验目的来优化确定最佳的染料浓度。

Midi Kit(CAT#:MX4021-200UL)适用于中量研究。当使用2ml染色体积(含2μM 终浓度的PKH26),本试剂盒含有足量的染料用于检测50次细胞样本(2×107个细胞/次),和足量的Diluent C用于30次细胞样本(2×107个细胞/次)。用户需根据细胞类型和实验目的来优化确定最佳的染料浓度。

Maxi Kit(CAT#:MX4021-500UL)适用于大量或体内研究。当使用2ml染色体积(含2μM 终浓度的PKH26),本试剂盒含有足量的染料用于检测125次细胞样本(2×107个细胞/次),和足量的Diluent C用于30次细胞样本(2×107个细胞/次)。用户需根据细胞类型和实验目的来优化确定最佳的染料浓度

产品包装

组分             名称

货号(规格)

MX4021-100UL     MX4021-200UL   MX4021-500UL  
MX4021-A PKH26 Dye (1×10-3M in EtOH)      1×100μl 2×100μl 5×100μl
MX4021-B Diluent C 1×10ml 2×30ml 2×30ml

保存与运输方法

保存:2-8ºC避光保存,1年有效。其中组分A(PKH26 Dye)需严格避光,盖子保持拧紧。

运输:冰袋运输。

注意事项

1)   PKH26是以溶于乙醇的储存液形式提供,保存的过程中需避光并拧紧盖子,以防止溶液挥发引起的染料浓度提高。使用前需检查是否有结晶,若有结晶,需在37℃水浴溶晶,超声或涡旋直至完全溶解。

2)   Diluent C使用前需置于室温回温之后再配制标记用的细胞和染料工作液。Diluent C是无菌溶液,不含任何防腐剂或抗生素,使用和保存过程中都注意无菌。

3)   PKH26不能保存在Diluent C内,保存在Diluent C的染色工作液需在使用前配制,现配现用。

4)   荧光染料均存在淬灭问题,操作和储存过程中需注意避光,以减缓荧光淬灭。

5)   为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

操作步骤

一、 自行准备仪器和试剂(试剂盒不提供,用于常规细胞膜标记)

﹒良好分散,均匀的单细胞悬液(悬浮于组织培养基)

﹒含血清的组织培养基(完全培养基)

﹒不含Ca2+、Mg2+和血清的培养基,或生理盐溶液(比如,DPBS或HBSS)

﹒血清,白蛋白或其他系统兼容的蛋白

﹒聚丙烯锥底离心管(4-15ml)

﹒能控温的离心机(高达1000×g)

﹒荧光分析用仪器(荧光酶标板,荧光或共聚焦显微镜,流式细胞仪)

﹒无菌层流净化罩

﹒血球计数板或自动细胞计数装置

﹒载玻片和盖玻片

二、 常规细胞膜标记

【注意事项】:

1)   通过分配脂质染料进入细胞膜来进行标记。标记强度是染料浓度和细胞浓度共同作用的一种功能,且不会饱和。因此,用来标记的染料浓度需要有限,过度标记细胞会引起细胞膜完整性丧失和降低的细胞复原能力。

2)   以下步骤适用于体外或离体标记干细胞、淋巴细胞、单个核细胞、内皮细胞、神经元或任何需要将染料插入细胞膜脂质区的其他细胞类型。而体内标记、血小板标记,或在含非吞噬细胞的群体内选择性标记吞噬细胞,需对步骤做适当修改。

3)   需在单克隆抗体染色前进行常规细胞膜染色。4℃单克隆抗体染色过程中膜染料仍能维持稳定。然而,如果单抗标记后再室温下进行常规细胞膜染色,极有可能引起单抗的“盖帽”发生。

4)   以下步骤中用到的细胞和染料浓度是推荐用的起始浓度,广谱适用于各种细胞类型。用户需根据自身细胞类型和实验目的确定最佳的染料和细胞浓度,通过对染色后细胞活力(比如碘化丙啶排斥),荧光强度,染色均匀性和对待研究细胞功能无影响等方面来综合评估。

5)   PKH26染色过程中需避免叠氮化物或代谢毒物的存在。

6)   虽然粘附在固相基质上的贴壁细胞可能被标记,使用单细胞悬浮液能得到更匀质的染色结果。染色前使用蛋白消化酶比如胰酶/EDTA处理贴壁或结合细胞制备成分散的单细胞悬液能得到最好的染色结果。

【染色流程】:

以下操作流程使用2ml最终染色体积,含2μM PKH26,以及1×107个细胞/ml。

以下所有步骤都在室温下进行(20-25℃)。

1.1    取一锥底聚丙烯离心管制备2×107个细胞的单细胞悬浮液,用无血清培养基清洗细胞一次。

【注意】:血清蛋白和脂质也会结合染料,降低用于膜标记的有效染料浓度。用无血清培养基或缓冲液(Step 1.1)清洗细胞一次,然后再用Diluent C重悬细胞用于标记能得到最佳结果。

1.2    400×g离心细胞5min,得到松散的细胞沉淀。【注意】:PKH26乙醇储存液不能直接加入细胞沉淀上,否则会引起异质染色和降低的细胞活力。

1.3    细胞离心后,轻轻吸掉上清。注意不要移动任何细胞并且残留不超过25μl上清液。

【注意】:为了得到重复性结果,最小化残留培养基或缓冲液很重要,然后再将细胞重悬在Diluent C中。

1.4    加1ml Diluent C到细胞沉淀中制备成2×细胞悬液,用枪轻轻吹匀以确保完全分散。不可涡旋和不可让细胞长期保留在Diluent C中。

【注意】:生理盐离子的存在导致染料形成胶团,实质上降低染色效率。因此,染料添加的时候细胞悬浮在Diluent C中很重要,而不是在培养基或缓冲盐溶液中。

1.5   染色前立即制备2×染色液(4μM in Diluent C):通过将4μl PKH26乙醇储存液到1ml Diluent C中,充分混匀分散所得。

【注意】:

a)为了最小化乙醇对细胞活力影响,Step 1.5中加入的染料体积产生占Step 1.6中不超过1-2%的乙醇量;b)若想得到<2μM的最终染料浓度,用未变性的100%无水乙醇稀释试剂盒提供的PKH26乙醇储存液到一中间染料浓度,能得到最好的重复染色结果。

1.6   快速加1ml 2×细胞悬液(Step 1.4)到1ml 2×染色液(Step 1.5),用枪立即混匀样本。混匀后样本得到的终浓度是1×107个细胞/ml 和2μM PKH26。

【注意】:由于染色几乎是一瞬间发生,在染色工作液中快速且均匀分散细胞对得到明亮、一致和重复的标记结果至关重要。以下措施都有利于得到优化结果:

a.       不要将PKH26乙醇储存液直接加到2×染色液(4μM in Diluent C)中。

b.       混匀等体积的2×细胞悬液(Step 1.4)和2×染色液(Step 1.5)。

c.       调整2×细胞悬液和2×染色液体积,避免在很小(<100μl)或很大(>5ml)体积。

d.       使用自动移液器或相同产品用于快速添加细胞和与染料混匀。血清学移液管很慢,得到相对更不一致的染色。“推压”或涡旋也很慢,得到相对更不一致染色。

e.       尽可能精确加量体积,为了精确重复每个样品间和每个研究间用到的细胞和染料浓度。

1.7    Step 1.6中的细胞/染料悬液孵育1-5min,中间定期混合。染色过程非常快,更长时间无任何益处。

【注意】:以获得理想染色结果的最短时间进行细胞孵育。由于Diluent C不含生理盐,更长的细胞孵育可能引起某些细胞类型活力降低。如果猜测可能有此效应产生,那么同时设置一个仅含Diluent的对照和一个使用乙醇染色而不是染料染色的阴性对照(mock-stained control)。

1.8    加入等体积(2ml)血清或其他适当蛋白溶液(比如1% BSA),孵育1min允许结合多余的探针。

【注意】:

a.血清(或等蛋白浓度溶液)更适合用作终止液。如果用完全培养基直接替代血清提高加入体积到10ml。

b. 在终止染色反应前不要通过加入Diluent C或离心细胞到Diluent C来终止。

c.不要使用无血清培养基或生理盐溶液,会引起细胞相关染料聚合物产生。染料聚合物好比未结合染料的“缓释水池”,通过清洗不能有效去除,且会转移到实验体系中的未标记细胞上。

1.9    20-25℃,400×g离心细胞10min,轻轻吸掉上清,确保不会移动细胞。用10ml完全培养基重悬细胞,转移到一个干净无菌的锥底聚丙烯离心管中,20-25℃,400×g离心细胞5min。然后用10ml完全培养基清洗细胞沉淀>2次,以确保完全去除未结合染料。

【注意】:转移到一干净离心管内能增加清洗效率,通过最小化结合到管壁上的残留染料的交叉污染;不要使用Diluent C用于清洗。

1.10  最后一步清洗后,用10ml完全培养基重悬细胞沉淀,用来评估细胞回收,细胞活力和染色强度。离心和重悬沉淀到一理想终浓度的活细胞悬液。

【注意】:

a.       染色细胞可能用1-2%中性缓冲甲醛固定,若样本避光保存荧光强度可稳定保存至少3周。

b.       染色通常比背景自荧光至少强100-1000倍。荧光分布必须匀称,且尽量均质,虽然染色CV取决于染色细胞类型。

PKH26客户使用案例(逐步增加中。。。。。。)

 图片描述:巨噬细胞(106个/mL)经PKH26(MKBio, 货号:MX4021-100UL,使用浓度:4uL/mL,5min)标记,荧光显微镜(Ex/Em=551nm/567nm)检测。【数据来源:华东理工大学药学院 李老师】

图片描述:斑马鱼体内给PKH26(MKBio,货号:MX4021-100UL)标记以及荧光成像。【数据来源:兰州大学医学院 潘老师

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MX3009-5MG CFDA, SE细胞增殖示踪荧光探针 5mg
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MX3011-50UG       Calcein, AM, Ultra Pure Grade钙黄绿素(绿色) 50μg
MX4021-100UL PKH26 Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling

PKH26细胞连接试剂盒(用于常规细胞膜标记)

100μl
MX4007-50UG Celltracker CM-DiI 活细胞示踪剂CM-DiI(红色) 1×50μg
MX4001-10MG DiO (DiOC18(3))细胞膜绿色荧光探针 10mg
MX4002-10MG DiI (DiIC18(3))细胞膜橙红色荧光探针 10mg