描述

ROSGreen^TM H₂O₂ Probe 过氧化氢荧光探针

搜索关键词：

Hydrogen Peroxide 过氧化氢；H2DCFDA (DCFH-DA, DCFH)；BES-H2O2-Ac；APF 氨基苯基荧光素; Mitosox Red;

同义名：

ROSGreen^TM Hydrogen peroxide Probe；ROSGreen^TM Hydrogen peroxide sensor；ROSGreen^TM H2O2sensor；

产品信息

产品描述

过氧化氢（Hydrogen peroxide, H2O2）是一种反映氧代谢副产物，用于许多氧化应激相关态的关键调节剂，参与人体大量的生理和病理活动，比如哮喘、动脉粥样硬化、糖尿病血管病变、神经性衰退疾病和唐氏综合征等，但目前对H2O2生成、积累、运输和功能的分子机制仍了解很少，最大的限制在于缺乏灵敏且特异性H2O2探针，用于活细胞研究。目前能得到的H2O2反应性探针的缺陷包括1）来自其他ROS比如过氧亚硝基阴离子（ONOO-）、过氧化基（ROO•）、超氧化物（•O2–）的背景荧光干扰；2）对外源活化酶的需求；3）水缺乏水溶性或不兼容于水溶体系；4）以及紫外区域的激发光谱特征等。

本ROSGreenTMH2O2Probe正是克服以上缺陷开发的一款过氧化氢（H2O2）选择性探针。探针本身无荧光，可见光区域内无吸收峰。一旦接触H2O2，瞬间激发荧光增加并伴随可见波长吸收带的生成（Ex/Em= 490/514nm）。因其二元的吸收/发射荧光反应，此探针具有较大的动力学范围。与相似的ROS比如O2–，NO，或OCl-相比，ROSGreenTMH2O2Probe对H2O2呈现出＞100倍（100-fold）的选择性。

保存与运输方法

保存：-20ºC避光干燥保存，至少1年有效。

运输：冰袋运输。

注意事项

1）本品的DMSO储存液需分装成单次用量后，-20ºC避光保存，避免反复冻融。所有工作液现配现用。

2）整个操作过程中注意避光。

3）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

1、储存液制备

将低温保存的产品从冰箱取出，置于室温回温至少20min。低速离心3-5min。之后往瓶内加入适量无水DMSO充分溶解配成2~5mM储存液（比如，1mg ROSGreenTMH2O2Probe（Mw: ~ 600）加入333μl DMSO，充分溶解混匀后即得到5mM储存液）。按照单次用量分装冻存，避免反复冻融，至少3个月稳定。

2、工作液准备

正式实验前，或取粉末按照【储存液制备】用DMSO溶解，或于室温融化一管DMSO储存液。

2.1 对于溶液H2O2测定，按照2~20μM工作液浓度制备2×工作液，用20mM Hepes缓冲液或其他缓冲液（pH 7.0）稀释储存液。工作液现配现用。建议使用5μM终浓度的ROSGreenTMH2O2Probe，测定溶液体系中H2O2浓度。

2.2 对于细胞H2O2测定，按照2~20μM工作液浓度制备1×工作液，用含20mM Hepes缓冲液的HBSS，pH 7.0 或PBS稀释储存液。工作液现配现用。

3、 上清液H2O2测定

【以下为溶液H2O2测定的推荐步骤，仅作参考，请根据具体需求做优化调整。】

3.1 于96孔板，加50μl 2×ROSGreenTMH2O2Probe工作液到每个孔（H2O2标准、空白对照、待测样本）内使总的测定体积为100μl/孔。【注意：对于384孔板，加25μl样品和25μl 2×ROSGreenTMH2O2Probe工作液，使得测定体积为50μl/孔。】

3.2 室温避光孵育反应体系15~60min。

3.3 荧光酶标板内监测用荧光增强，Ex/Em=490/525nm。

3.4 空白孔（只含有反应缓冲液）的荧光用作对照，其他孔的荧光值需减掉空白对照孔荧光。

4、活细胞H2O2测定

【ROSGreenTMH2O2Probe能主动扩散进入活细胞，且能反映胞内H2O2微摩尔浓度变化。以下是推荐的活细胞H2O2显微成像检测步骤，仅作参考，可根据具体需求优化调整。】

4.1 按照步骤2.2配制1×ROSGreenTMH2O2Probe工作液。工作液现配现用。

4.2 按照实验要求处理细胞。

4.3 用1×ROSGreenTMH2O2Probe工作液避光孵育细胞5~60min或适合自身需求的时间。用PBS清洗细胞2次。

4.3 用荧光酶标板（底部读数模式）监测荧光增强，Ex/Em=490/525nm。或者用荧光显微镜的FITC通道成像检测荧光增强。

染色示例

图1. Costar 黑色96孔培养板内CHO-K1活细胞用ROSGreenTMH2O2Probe的染色图。图A：对照细胞；图B：用H2O2（100μM）处理5min后的细胞；

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